干货 | 精准施策，检测领航！NGS技术引领肿瘤个性化治疗新时代

图1.基因检测参与肿瘤全生命周期管理（网图，侵删）

基因检测在肿瘤全生命周期管理中发挥着至关重要的作用，从早期筛查、诊断、治疗监测到预后管理，每个阶段都涉及到基因检测技术的应用。

高通量测序(NGS)又被称为下一代测序技术，推动癌症研究及临床诊疗进入了基因组时代。也使得基于肿瘤突变特征的精准医疗成为现实。NGS能够一次性、特定时间内产生覆盖基因组特定区域，从数个基因到数百个基因以至外显子组、转录组和全基因组的通量数据。同步获得多基因、多位点、多种变异形式的分子检测结果。尽管目前NGS的多基因多重分析总成本较高，但相对于传统检测方法而言，单个基因、单个位点的检测费用已经大幅度下降。

首先，建立DNA模板文库。通过随机打断基因组DNA获得长度为数十到数百碱基的DNA文库片段，或者构建控制距离分布的配对未端片段。随后，将接头序列连在双链片段的两端，使得片段变性得到单链模板文库，再将其固定在固体表面上。克隆的扩增方式包括桥式PCR、微乳滴PCR或原位成簇等。在芯片上形成DNA簇阵列的DNA簇或扩增微球，再利用聚合酶或者连接酶进行一系列循环的反应操作，循环生化反应中产生的光学事件被显微检测系统监控，在图像被采集并记录后，再对产生的阵列图像进行时序分析。

图2.NGS的关键技术步骤（沙利文）

图3.肿瘤NGS检测的常见变异类型

肿瘤NGS检测中国有一系列的专家共识来对临床检测进行规范和指导，比如ctDNA 高通量测序临床实践专家共识(2022年版）的关键信息如下：

ctDNA(ctDNA)是由肿瘤细胞主动分泌或肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放入循环系统的DNA片段:其丰度受多种因素影响,波动较大,在内外因素特别是治疗压力下,其携带的生物信息可能会发生演变且受正常细胞胚系变异或克隆性造血细胞体系突变干扰。

目前已有临床证据支持ctDNAN GS检测 可应用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等晚期实体肿瘤的伴随诊断。ctDNA NGS检测已被国内外专家共识或指南建议作为多种晚期恶性肿瘤组织基因检测的替代方式。

晚期实体肿瘤分子靶向或免疫检查点抑制剂治疗开始后,基于NGS检测的ctDNA水平定量和动态变化分析，有望成为新兴的疗效评估途径。ctDNA MRD检测是全新的个性化技术应用领域,尚难以建立通用性技术标准。在临床环境中,ctDNA NGS检测可用于识别分子靶向治疗的耐药机制,尤其对于疑难复杂的肿瘤患者,该结果有助于后续的治疗选择决策。

ctDNA NGS检测样本采集建议采用含细胞稳定剂的抗凝管,尽快完成血浆分离,提取的ctDNA建议在 24h内进行后续检测,否则，置于-30℃至-15 ℃下储存并避免反复冻融。

对于不同的单癌种NGS检测，有对应的专家共识，专家共识会明确规范从样本到报告解读的标准和注意事项，可以根据不同的应用需求进行查阅。

一般情况下,适合于 NGS 检测的组织标本中肿瘤细胞含量建议应达到 20%以上。如果肿瘤细胞占比较低,患者知情后依然愿意进行 NGS 检测,应尽量采用显微切割技术富集肿瘤细胞,或增加 NGS 测序数据量以提高测序覆盖深度,并在报告中提示样本局限性。组织样本抽提获得的 DNA 量应达 50 ng 以上用于NGS检测。血液样本建议采血至少8ml,分离血浆游离 DNA 用于 NGS 检测。

FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）：按病理操作规范进行取材。手术或活检离体的组织应在30min内浸人100ml的4%甲醛溶液中进行固定,避免使用酸性及含有重金属离子的固定液。大标本应切开后充分固定至6~48h,不超过72 h。小活检标本可固定6~12 h。开展 NGS 检测前应进行 HE 染色评估肿瘤细胞的含量。

对于手术和活检的新鲜组织:理想的保存方法是迅速置于液氮中,可保存于液氮罐或-80℃冰箱,该过程应在手术离体后 30 min内完成,以防止RNA等核酸降解;或采用保存在样本保护剂中,尽早转移到-80℃冰箱保存。可采用冷冻切片染色评估样本中的肿瘤细胞含量。

细胞学样本:脱落细胞学标本及细针穿刺细胞学标本用于基因检测时,必须进行病理质控,确定标本中的肿瘤细胞数量及与正常细胞的比例,符合质量要求或通过肿瘤细胞富集处理后符合要求的标本可直接抽提核酸,也可以制备成 FPE 细胞学蜡块进行后续分析。体腔积液标本可提取无细胞上清标本中的循环肿瘤 DNA(ctDNA)进行检测。

采集外周血提取血浆游离 DNA 进行检测,取样时应使用一次性的含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝真空采血管,采集8~10 m全血,冷藏运输,2h内分离血浆,提取游离 DNA,保存于-80 ℃冰箱中,并避免反复冻融。如外周血需长时间运输,建议用商品化的游离 DNA 样本专用保存管,在常温条件下,ctDNA 在全血中可稳定保存3~7 d。由于血细胞基因组 DNA 的潜在大量释放会极大地稀释血浆游离肿瘤 DNA 的浓度,经肉眼观察确认为溶血的样本不适用于对游离肿瘤DNA的NGS检测。当怀疑血浆游离DNA受到血细胞基因组DNA 污染时,可考虑采用核酸片段大小分布分析来判断污染是否存在,而从判断样本是否适用于NGS检测。

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