PBMC来源巨噬细胞分化与表型调控：核心细胞因子的作用解析

外周血是指除骨髓之外的、在全身循环系统中流动的血液。它与“骨髓血”相对。我们日常抽血化验（如指尖血、静脉抽血）所获取的都是外周血。

外周血由血浆和血细胞两部分构成。血浆作为血液的液体部分，约占外周血总体积的55%，主要成分是水，还含有电解质、激素、白蛋白、凝血蛋白等物质。血细胞包含红细胞、白细胞、血小板等，其中红细胞负责运输氧气和二氧化碳，白细胞参与免疫防御以对抗病原体，血小板则在止血和凝血过程中发挥关键作用。此外，外周血中还含有极少量造血干细胞，含量约为0.01%左右。

PBMC的全称是外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell）。

1)来源：外周血（动脉、静脉、毛细血管循环血），通过密度梯度离心（Ficoll-Paque法）从全血中分离获得。
2)核心特征：仅含单个细胞核，排除多叶核细胞（粒细胞）和无核细胞（红细胞、血小板）。
3)本质：机体免疫系统的“核心细胞库”，承担免疫防御、免疫调节等关键功能。

从单核细胞到巨噬细胞，人体内，这个过程是自然发生的：

1.单核细胞在骨髓中产生，然后释放到外周血中（因此，单核细胞是PBMC的组成部分之一）。
2.单核细胞随血液循环，当接收到炎症或组织损伤的信号时，会穿过血管壁进入组织。
3.在特定的组织环境中，单核细胞分化成熟为巨噬细胞。巨噬细胞是定居在组织中的“清道夫”和免疫调节者，功能更强大。

在实验室中，我们模拟了这个过程：

PBMC（分离自外周血）→提取出单核细胞→体外培养+细胞因子刺激→分化成巨噬细胞

健康志愿者外周血（使用肝素钠或EDTA抗凝管采集）；Ficoll-Paque PLUS等淋巴细胞分离液；D-PBS（杜氏磷酸缓冲盐溶液），不含钙镁离子；RPMI-1640或DMEM完全培养基（基础培养基+10%胎牛血清+1%青霉素/链霉素）。

1.用等体积的D-PBS稀释血液。

2.将稀释后的血液小心地加在已分装好的Ficoll液面上，保持清晰的界面。

3.离心：在室温下，以400 g离心30-35分钟。

4.离心后，液体分为多层。用吸管小心吸取中间白色云雾层（即PBMC层），转移到新离心管中。

5.用PBS洗涤细胞2-3次（以250-300 g离心10分钟），去除残留的血小板和Ficoll。

6.用适量完全培养基重悬细胞，并进行细胞计数。

获得PBMC后，需要从中富集单核细胞，贴壁法是最常用且经济的方法。

单核细胞具有极强的贴壁能力，而淋巴细胞贴壁能力差。通过短时间培养，可使单核细胞与淋巴细胞分离。

1.将重悬后的PBMC悬浮液加入细胞培养瓶或培养板中。

2.在37°C、5% CO?的培养箱中静置1-2小时，让单核细胞充分贴壁。

3.孵育结束后，轻轻晃动培养器皿，然后将上清液吸出。上清液中主要含有未贴壁的淋巴细胞（T细胞、B细胞、NK细胞等）。

4.向培养器皿中加入预温的D-PBS，轻轻晃动并吸出，以洗去未贴壁或贴壁不牢的细胞。此步骤重复2-3次。

5.洗涤后，留在瓶/板底部的就是纯度较高的单核细胞。

这是最关键的一步，将单核细胞转化为成熟的巨噬细胞。

1.向已贴壁单核细胞的培养器皿中加入含M-CSF的完全培养基。

2.放入37°C、5% CO?培养箱中培养。

3.分化时间：通常需要5至7天。

4.形态学变化：在倒置显微镜下观察，前几天细胞会逐渐变大、伸展，从圆形变为不规则形，并伸出伪足，最终形成典型的巨噬细胞形态（铺路石样）。

5.换液：通常在培养的第3天或第4天进行半量换液，补充新鲜的含M-CSF的培养基，以提供营养和因子。

1.无菌操作：整个流程必须在超净工作台中进行，严防微生物污染。
2.细胞因子选择：

又称CSF-1，是单核细胞分化为成熟M0型巨噬细胞的关键因子。它能调控单核细胞的存活、增殖与分化，诱导单核细胞逐渐转变为体积增大、贴壁生长的成熟巨噬细胞，同时还能增强巨噬细胞的吞噬能力，比如对血小板、葡聚糖等物质的吞噬活性。此外，该因子还会促使巨噬细胞高表达CD14、CD163等表型分子，为后续向M2型极化奠定基础。

既能诱导PBMC中的单核细胞分化为巨噬细胞，又具有促炎倾向。与M-CSF不同，它诱导分化的巨噬细胞低表达CD14、CD163等M2相关表型，反而高表达HLA-DR等抗原递呈相关分子。这类巨噬细胞后续更易向M1型极化，且在分化过程中能增强巨噬细胞的抗原递呈能力，为启动机体炎症反应做准备。

可作为M-CSF的替代因子，其诱导单核细胞分化为巨噬细胞的效果与M-CSF类似。由它诱导产生的巨噬细胞更接近体内真实的肿瘤相关巨噬细胞表型，这一特性让其在肿瘤相关巨噬细胞的模拟培养及药物筛选实验中具有独特优势。

这类因子主要诱导巨噬细胞呈现促炎特性，强化其抗感染和抗肿瘤能力。其中，干扰素-γ（IFN-γ）是核心启动因子，能激活巨噬细胞内的炎性信号通路，显著增强巨噬细胞对病原体和肿瘤细胞的杀伤能力，同时上调CD86、MHC-Ⅱ等促炎相关分子的表达；脂多糖（LPS，虽非细胞因子，但常与细胞因子协同作用）搭配IFN-γ使用可产生协同效应，进一步放大巨噬细胞的促炎反应，例如大量分泌TNF-α、IL-1等炎性细胞因子，大幅提升巨噬细胞的免疫激活功能。

该类因子能让巨噬细胞偏向抗炎和组织修复功能，减少炎性因子释放。白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）是经典组合，二者共同作用可诱导巨噬细胞高表达CD206、CD163等M2标志性分子，同时抑制促炎因子分泌，推动巨噬细胞参与组织损伤后的修复过程，比如促进细胞外基质合成；白细胞介素-10（IL-10）则侧重强化巨噬细胞的抗炎效应，它能进一步抑制M1型巨噬细胞相关的炎性反应，维持巨噬细胞的免疫耐受状态，在减轻炎症损伤、维持机体内环境稳定方面发挥重要作用。

Bioactivity of Mouse M-CSF

图1. Measured in a cell proliferation assay using M-NFS-60 mouse myelogenous leukemia lymphoblast cells. The EC₅₀ for this effect is 0.2-1.5 ng/mL.

Bioactivity of Human GM-CSF

图2. The ED50 as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.1 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 1.0 × 10⁷ IU/mg.

Bioactivity of human IFN-γ

图3.The ED₅₀ as measured in anti-viral assays using human HeLa cells infected with encephalomyocarditis (EMC) virus is 0.15-0.80 ng/mL. Fully biologically active when compared to standard.

Bioactivity of human IL-4

图4.The ED₅₀ as determined by a cell proliferation assay using human TF-1 cells is less than 0.2 ng/mL, corresponding to a specific activity of > 5.0 × 10⁶ IU/mg. Fully biologically active when compared to standard.