干货分享 | 细胞检测与分析

细胞检测与分析是指利用各种技术和方法来研究细胞的结构、功能、状态以及其在不同条件下的变化。这些技术和方法广泛应用于生物学、医学、药学等领域，对于疾病的诊断、药物的开发和基础科学研究都具有重要意义。

细胞增殖与毒性

1、MTT（噻唑蓝）
MTT是一种可接受氢离子的化合物染料，带正电荷，具有细胞膜渗透性。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源进入的MTT还原成为水不溶性的深蓝色MTT-甲臜结晶，而死细胞不具有此功能。甲臜结晶是不能穿透细胞膜，因此沉积在处于增殖且未受损伤的细胞内。甲臜结晶可用DMSO或者酸化的异丙醇溶解出来，酶标仪下测定570 nm的吸光度反映甲臜的生成量。而甲臜的生成量与活细胞数目成正比，用以评估细胞存活状况。

2、CCK-8（Cell Counting Kit–8）
CCK-8中的WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。基于CCK-8（WST-8）的试剂盒能高度准确地检测细胞增殖，比MTT法及XTT法的灵敏度高5倍，能检测更低的细胞数目。CCK-8可直接加入细胞样品中，因此适合悬浮细胞和贴壁细胞的检测。对细胞几乎没有毒性， 检测完成后的细胞还可以继续培养使用。

1、BrdU
Brdu，也称为溴化去氧尿苷，一种合成的胸苷类似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中。从而检测细胞DNA合成和标记细胞分裂，凋亡等行为。

2、EdU
EdU法检测是Brdu方法的升级和突破。EdU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）是一种嘧啶类似物，可在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。

ATP是细胞内最重要的能量分子，可以用来衡量细胞新陈代谢水平，并与活细胞数目具有良好的线性关系，因此，可通过ATP含量反应活细胞的数目。借ATP依赖的荧光素酶催化的荧光素发光反应，通过化学发光信号测定细胞内 ATP含量，从而检测细胞活力或定量检测活细胞数目，灵敏度高、线性范围宽。

Calcein-AM是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490 nm，Em=515 nm）。 因其在传统的Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。

细胞凋亡与吞噬

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36 kDa的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

Hoechst 33342 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，它在嵌入双链 DNA 后释放强烈的蓝色荧光，对细胞的毒性较低。Hoechst 33342 常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。也可以用于普通的细胞核染色，或常规的DNA染色。

组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA会发生断裂，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3′-羟基（3′-OH）末端掺入FITC-12-dUTP，从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测。

JC-1/JC-10是一种阳离子脂质荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位指示剂。JC-1/JC-10有单体和多聚体两种存在状态，低浓度时，以单体存在，可检测到绿色荧光，用流式检测时，通常为FL-1通道(和FITC同通道）高浓度时，以多聚体存在，可检测到红光，流式检测通常为FL-2通道（和PE同通道)。因JC-1/JC-10浓度的变化,在单体和多聚体之间形成一个可逆的转变过程。

正常细胞，膜电位正常时，JC-1/JC-10通过线粒体膜极性进入线粒体内，并因浓度升高而形成发射红色荧光的多聚体，而凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1/JC-10从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。故而可以通过检测绿色和红色荧光检测线粒体膜电位的变化。

细胞衰老

细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到蓝色着色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。

细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S  期、G2期和M期组成。衰老的细胞阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应能力和合成DNA的能力，不能进入S 期。

PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与 DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个时期的百分含量。

亚细胞研究

细胞骨架是一个动态且自适应的结构网络，由微管、肌动蛋白丝和中间丝三种主要聚合物组成，在细胞内执行多种重要功能，包括空间组织、与外部环境连接以及产生力使细胞移动和变形，其功能通过众多细胞质蛋白和细胞器的整合活动实现。

线粒体是细胞的能量工厂，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，为细胞的活动提供了能量，细胞生命活动所需的能量95％来自线粒体。除了为细胞供能外，线粒体还参与诸如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。

细胞核的结构有核膜、核仁、染色质、核基质。主要功能是遗传物质DNA储存和复制的主要场所，是细胞遗传和代谢的控制中心。

1.核膜：双层膜，其上有核孔，是细胞核与细胞质之间的物质交换通道，表现出明显的选择性，RNA、蛋白质等大分子进出必须通过核孔。
2.核仁：在细胞有丝分裂过程中周期性消失（前期）和重现（末期）。
3.染色质：能被碱性染料染成深色的物质，主要由DNA和蛋白质组成。
4.核基质：是核中除染色质与核仁以外的成分，包括核液与核骨架两部分。

溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器。溶酶体具单层膜，形状多种多样，是0.025～0.8微米的泡状结构，内含许多水解酶。溶酶体在细胞中的功能是分解从外界进入到细胞内的物质，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。溶酶体的基本功能是对生物大分子的强烈消化作用,这对于维持细胞的正常代谢活动及防御微生物的侵染等都有重要的生物学意义。

内质网是细胞内的一个精细的膜系统。是交织分布于细胞质中的膜的管道系统。两膜间是扁平的腔、囊或池。内质网有两种类型，一类是在膜的外侧附有许多核糖体，这种内质网叫粗糙型内质网或叫粗面内质网；另一类在膜的外侧不附有核糖体，表面光滑，称光滑型内质网或叫滑面内质网。内质网外与细胞膜相连，内与核膜的外膜相通，将细胞中的各种结构连成一个整体，具有承担细胞内物质运输的作用。内质网能有效地增加细胞内的膜面积，内质网能将细胞内的各种结构有机地联结成一个整体。

细胞膜，又称细胞质膜（plasma membrane），厚度约为7～8nm，细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。其中，脂质的主要成分为磷脂和胆固醇。此外，细胞膜中还含有少量水分、无机盐与金属离子等。细胞膜作为细胞的边界可将细胞内部与外环境分隔开，不仅在结构上为细胞提供了相对稳定的内环境，并参与了包括物质运输、信号转导、细胞凋亡和细胞自噬在内的许多重要生理活动。