干货分享 | 一文带你看懂寡核苷酸药物代谢产物分析

治 疗性寡核苷酸有着独特的基因表达调控优势，随着其成药性潜力被不断挖掘，与其相关的研发、生产和商业化进程得到快速发展。与传统化学药物的研究过程类似，寡核苷酸药物临床前均需要进行体外和体内的代谢行为研究，阐明药物药效及代谢途径。

寡核苷酸药物的代谢行为

寡核苷酸药物的代谢行为与小分子药物存在很大不同，它几乎不经肝微粒体酶代谢，主要通过血液和靶器官中核酸内切酶和核酸外切酶水解磷酸酯键形成小的核酸片段。从3’-端通过核酸外切酶水解生成主要代谢产物，其次是5’-端通过核酸外切酶水解产物及核酸内切酶产生的代谢物。为了提高寡核苷酸药物的稳定性、药效及安全性，药物会被化学修饰，包括硫代磷酸、2’-O-甲氧基乙基核糖、N-乙酰化半乳糖胺修饰。寡核苷酸药物的药代动力学性质与核酸磷酸主链及核糖的化学修饰类型密切相关。

寡核苷酸药物代谢产物鉴定

目前寡核苷酸药物代谢产物鉴定的主要分析方法是基于LC-HRMS开展的，通过全扫描和二级碎片信息的采集，获得寡核苷酸及其代谢产物信息。沃特世高分辨质谱Xevo G3 QTof结合waters_connectINTACT Mass和CONFIRM Sequence应用程序平台，为寡核苷酸代谢物鉴定提供有效解决方案。

寡核苷酸药物代谢物产物鉴定中的分析难点

1)色谱分离

寡核苷酸药物分子具有强极性，利用常规反相色谱分离方法较难保留，通常使用反相离子对色谱（IP-RPLC）、亲水色谱（HILIC）、离子交换色谱（IEX），其中IEX和IP-RPLC的分离度优于HILIC，但是IP-RPLC跟质谱兼容性更好。由于寡核苷酸药物代谢物复杂，且存在与母药性质非常接近的n-1代谢物，给分离带来很大挑战。所以目前寡核苷酸药物代谢产物鉴定以IP-RPLC为常用方法，使用三乙胺（TEA）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）、乙酸三乙胺（TEAA）等和六氟异丙醇（HFIP）组成离子对试剂。

由于寡核苷酸药物分子的多负电性，在色谱分离系统中存在非特异吸附问题，严重影响色谱分离度和低含量代谢物的发现。沃特世ACQUITY Premier系统采用Max Peak高性能表面技术，能够减少金属敏感分析物的非特异性吸附，减少分析物损失，提高分析重现性。针对寡核苷酸药物色谱分离难点，Premier技术可以显著改善寡核苷酸药物的峰形、回收率和重现性，无需系统和色谱柱钝化。

图1. 全硫代磷酸化寡核苷酸反义药物GEM91 ACQUITY Premier方案和标准方案比较。

2) 高分辨质谱分析及代谢产物鉴定

通过Xevo G3 QTof提供高质量分辨率、灵敏度和可靠性，全扫描和二级碎片采集MSE技术结合，全面获得寡核苷酸及代谢产物的质谱信息。寡核苷酸的代谢产物鉴定和未知代谢物序列确认过程复杂，需要专业的软件进行辅助识别和分析。

waters_connect INTACT Mass应用程序，可以自动进行寡核苷酸质量确认，实现更快的样品分析。可定制的化合物库，允许终端用户输入自定义同位素模型，支持自动化核酸确认。

waters_connect CONFIRM Sequence应用程序平台可以自动确认治 疗药物及其代谢物的核酸序列，对未知代谢物进行序列确认。给定一个目标核酸序列，CONFIRM Sequence应用程序将自动生成一个预测碎片列表，并搜索这些碎片离子的二级质谱数据，标注所有匹配。该应用程序可以自动处理来自Xevo G3 QTof的MS/MS数据。当处理完成时，一个可视化的“点图”将显示寡核苷酸序列和所有已发现的片段以及序列覆盖率的百分比。

图2.核酸药物完整分子量分析结果。

图3. 核酸二级序列确认

案例分享

以ASO药物Eluforsen作为研究对象开展代谢物鉴定工作，利用LC-QTof平台实现Eluforsen及其代谢物的成功分离和检测，Eluforsen及其代谢物代表性色谱图见图4。结合UNIFI的数据处理功能，成功鉴定Eluforsen的代谢产物主要以3’端和5’-端的水解产物为主，结果见表1。利用LC-QTof平台也可以实现代谢产物形成速率的测定，结果见图5。

图4. 核酸药物Eluforsen及其代谢物的代表性提取离子流图。

图5. 小鼠肝脏匀浆中Eluforsen 3’端水解产物的形成速率。（50 μg/mL eluforsen与肝脏匀浆孵育0, 24, 48, 72, 96, 120 h）

表1. 纯化核酸酶和小鼠肝脏匀浆孵育后体外产生的Eluforsen代谢物以及小鼠和猴子肝脏和肺样品中体内产生的代谢物。

4) 总结

寡核苷酸药物因特殊的结构特点具有极性大、负电性等特性，给代谢物分离和鉴定都带来很大的挑战。沃特世Premier UPLC技术可以有效解决寡核苷酸药物非特异性吸附问题，提高IP-LC分离性能，提升低含量代谢物的检出率。Xevo G3 QTof全扫描和二级采集MSE技术结合，提供更全面的寡核苷酸及代谢产物质谱信息，利用waters_connect平台的数据处理能力实现寡核苷酸药物代谢产物鉴定和未知物确证。沃特世持续致力于提供更满足客户需求的寡核苷酸药物代谢研究的解决方案，助力客户加速药物研发。

参考文献：

1. Jaeah Kim, Babak Basir, Chopie Hassan, et. al., Molecular Therapy: Nucleic Acids, 2019, 17, 714-725.

2. Ju Liu, Jing Li, Chris Tran, et. al., Bioanalysis, 2019, 11(21), 1967-1981.