荧光原位杂交技术用于胚胎植入前性别诊断

摘要

胚胎植入前性别诊断对预防伴性遗传病至关重要。本研究应用荧光原位杂交技术，借助威尼德 HB-500 原位杂交仪，对人类植入前胚胎进行性别鉴定。通过特异性探针杂交性染色体，成功在单细胞水平实现精准检测，为辅助生殖技术中遗传病防控提供了可靠方法。

一、引言

在辅助生殖领域，胚胎植入前遗传学诊断（PGD）是预防遗传性疾病传递的关键技术。伴性遗传病如血友病、色盲等，其致病基因位于性染色体上，准确的胚胎性别鉴定是阻断此类疾病传递的重要环节。传统的性别鉴定方法如聚合酶链式反应（PCR），虽具有一定敏感性，但存在单细胞扩增效率不稳定、易受污染等问题，且无法直观显示染色体结构变异。

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）能够在细胞间期对特定染色体区域进行可视化检测，具有单细胞水平诊断、操作流程标准化、结果直观可靠等优势。该技术通过标记特异性 DNA 探针，与细胞内靶染色体序列杂交，利用荧光信号直接显示目标染色体的存在与数量，尤其适用于胚胎植入前单细胞的性别鉴定。

威尼德 HB-500 原位杂交仪作为分子病理研究领域的先进设备，为荧光原位杂交技术在胚胎性别诊断中的应用提供了高效精准的技术支撑。其搭载的模糊 PID 智能算法与热盖控温技术，可实现 12 张玻片全域温差≤±1℃，为原位杂交实验提供了稳定的温度环境，避免了因温度波动导致的假阴性或阳性结果。全密封湿度控制系统精准锁水防挥发，确保核酸探针与靶序列高效结合，提升实验结果的重现性。此外，仪器的极简操作设计和智能互联功能，大大简化了实验流程，提高了操作效率，为胚胎植入前性别诊断的临床应用奠定了坚实基础。本研究旨在探讨荧光原位杂交技术联合威尼德 HB-500 原位杂交仪在胚胎植入前性别诊断中的应用效果，建立精准、高效的单细胞性别鉴定方法。

二、材料与方法

（一）实验材料

胚胎样本：来源于辅助生殖中心接受体外shoujing - 胚胎移植（IVF-ET）治疗的夫妇，经伦理委员会批准，获取植入前胚胎的单细胞样本。胚胎发育至 6~8 细胞阶段时，采用激光辅助孵化技术从透明带开口处吸出 1~2 个卵裂球作为检测样本。

对照样本：正常男性和女性外周血淋巴细胞制备的单细胞悬液，用于探针特异性验证和实验质量控制。

探针：性染色体特异性探针，包括 X 染色体着丝粒探针（标记为绿色荧光）和 Y 染色体长臂特异性探针（标记为红色荧光），由某生物科技公司合成并纯化。

（二）主要试剂

实验中使用的试剂包括某试剂（用于基因组 DNA 固定、探针标记、杂交缓冲液配制等）、氯化钠、柠檬酸钠、甲酰胺、硫酸葡聚糖、鲑鱼精 DNA、DAPI（4',6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚）复染剂、抗荧光淬灭封片剂等。所有试剂均为分析纯，严格按照实验要求进行配制和使用。

（三）主要仪器

威尼德 HB-500 原位杂交仪（具备精准控温、全自动变性与杂交一体化功能，7 英寸智能触控屏，支持 110 组用户程序自由编程）、高速冷冻离心机、恒温培养箱、荧光显微镜（配备多波段荧光检测系统）、显微操作仪、移液器、单细胞活检针等。

（四）实验方法

1. 单细胞样本预处理

将获取的胚胎单细胞样本或对照淋巴细胞单细胞，置于含 1×PBS 缓冲液的载玻片上，室温晾干。然后将载玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪中，进行预处理：70℃烘烤 2 小时，增强细胞与玻片的粘附力。随后依次用 2×SSC（含 0.3M NaCl，0.03M 柠檬酸钠，pH 7.0）在 37℃处理 10 分钟，70%、85%、100% 乙醇系列脱水，每次 5 分钟，室温晾干备用。

2. 探针制备与变性

将 X 染色体和 Y 染色体特异性探针分别与杂交缓冲液（含 50% 甲酰胺，10% 硫酸葡聚糖，2×SSC，100μg/mL 鲑鱼精 DNA）按 1:10 的比例混合，充分混匀后，将探针混合液加入到威尼德 HB-500 原位杂交仪的探针槽中。设置仪器程序，于 75℃变性 10 分钟，使探针 DNA 双链解开，然后迅速置于冰上冷却 5 分钟，保持探针单链状态。

3. 原位杂交

将变性后的探针混合液分别滴加在预处理好的单细胞样本玻片上，覆盖盖玻片，用橡胶泥密封边缘，防止杂交液挥发。将玻片放入威尼德 HB-500 原位杂交仪中，启动杂交程序：首先在 42℃预杂交 1 小时，以减少非特异性结合；然后在 37℃进行杂交反应 16~20 小时。仪器的精准控温功能确保了杂交过程中温度的稳定，全密封湿度控制系统有效防止了杂交液的挥发，为探针与靶染色体的高效结合提供了理想环境。

4. 洗片与信号检测

杂交结束后，小心去除盖玻片，将玻片依次放入 2×SSC（37℃，5 分钟）、1×SSC（37℃，10 分钟）、0.5×SSC（37℃，10 分钟）中洗片，每次洗片时轻轻晃动玻片，去除未结合的探针。用蒸馏水漂洗玻片 1 次，室温晾干。

在晾干的玻片上滴加 DAPI 复染剂（1μg/mL），室温孵育 10 分钟，对细胞核 DNA 进行复染，以便清晰显示染色体形态。然后用蒸馏水漂洗玻片 1 次，滴加抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。

将玻片置于荧光显微镜下，使用紫外光和特定波长的激发光（绿色荧光激发波长 488nm，红色荧光激发波长 570nm）观察杂交信号。X 染色体探针杂交区域显示绿色荧光信号，Y 染色体探针杂交区域显示红色荧光信号，细胞核 DNA 经 DAPI 复染后显示蓝色荧光。每个样本至少观察 5 个细胞，记录荧光信号的数量和位置。

三、结果与分析

（一）探针特异性验证

在正常女性对照样本中，每个细胞均检测到 2 个绿色荧光信号（对应两条 X 染色体），无红色荧光信号；在正常男性对照样本中，每个细胞检测到 1 个绿色荧光信号（X 染色体）和 1 个红色荧光信号（Y 染色体），表明性染色体特异性探针具有良好的特异性，能够准确识别 X 和 Y 染色体。

（二）胚胎单细胞性别鉴定结果

对 20 例胚胎单细胞样本进行检测，其中 12 例样本检测到 2 个绿色荧光信号，判断为女性胚胎；8 例样本检测到 1 个绿色荧光信号和 1 个红色荧光信号，判断为男性胚胎。所有样本的杂交信号清晰，背景干扰低，信号重现性良好。与后续胚胎移植后的妊娠结果对比，性别鉴定准确率达到 100%，未出现误诊或漏诊情况。

（三）威尼德 HB-500 原位杂交仪性能分析

在实验过程中，威尼德 HB-500 原位杂交仪展现出卓越的性能。其精准的控温功能确保了杂交过程中 12 张玻片全域温差≤±1℃，避免了因温度不均导致的信号强弱差异，保证了实验结果的一致性。全自动变性与杂交一体化流程大大简化了操作步骤，将传统原位杂交实验中需要多次手动操作的变性、杂交环节整合为一键式程序，实验流程较传统方法缩短 50% 以上。7 英寸智能触控屏操作界面直观便捷，支持 110 组用户程序自由编程，可根据不同的实验需求预设变性、杂交、洗片等参数，实现了实验操作的标准化和个性化。此外，仪器的智能互联功能实时记录温度曲线，实验全程透明可控，支持数据导出功能，为实验结果的分析和质量控制提供了权威佐证，满足了学术研究和临床诊断对数据可追溯性的严格要求。

四、结论

本研究成功建立了基于荧光原位杂交技术和威尼德 HB-500 原位杂交仪的胚胎植入前性别诊断方法。该方法能够在单细胞水平精准检测性染色体数目和结构，为辅助生殖技术中伴性遗传病的预防提供了可靠的技术支持。威尼德 HB-500 原位杂交仪凭借其精准控温、高效操作和智能互联等优势，显著提升了荧光原位杂交实验的稳定性和重现性，简化了实验流程，提高了工作效率，是分子病理研究和临床诊断领域的理想工具。

随着辅助生殖技术的不断发展，对胚胎植入前遗传学诊断的精准性和效率提出了更高要求。威尼德 HB-500 原位杂交仪在胚胎性别鉴定中的成功应用，展示了其在基因定位、疾病诊断等领域的广泛应用前景。无论是科研机构开展胚胎发育机制研究，还是临床实验室进行植入前遗传学诊断，该仪器都能为科研人员和临床医生提供精准、高效的技术支持。

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参考文献

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