电转化外源质粒至干酪乳杆菌的研究

一、引言

二、材料与方法

（一）菌株与质粒

1. 菌株：本研究选用干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）[具体菌株编号] 作为宿主菌，该菌株购自 [菌种保藏机构名称]。

2. 质粒：采用具有特定筛选标记（如抗生素抗性基因）的外源质粒 [质粒名称]，其构建和来源见 [相关文献或实验记录]。

（二）培养基与试剂

1. 培养基

• MRS 培养基（de Man, Rogosa and Sharpe Medium）：用于干酪乳杆菌的培养与活化，其组成成分（g/L）为：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐温 - 80 1.0，磷酸氢二钾 2.0，乙酸钠 5.0，柠檬酸三铵 2.0，硫酸镁 0.58，硫酸锰 0.25，琼脂 15.0（固体培养基添加），pH 6.2 - 6.4。

• SOC 培养基：用于电转化后的细胞复苏培养，其组成成分（g/L）为：蛋白胨 20.0，酵母膏 5.0，氯化钠 0.5，氯化钾 0.186，硫酸镁 0.98，葡萄糖 3.6，pH 7.0。

2. 试剂

• 电击缓冲液：采用 10% 甘油 + 0.5 M 蔗糖溶液，用超纯水配制，经 0.22 μm 滤膜过滤除菌后备用。

• 抗生素：根据质粒所携带的筛选标记，选用相应的抗生素（如氯霉素、红霉素等），配制成适当浓度的储存液，使用时按所需终浓度添加至培养基中。

（三）仪器设备

1. 电穿孔仪（[品牌型号]）：用于施加电击脉冲，实现外源质粒的电转化。

2. 低温离心机（[品牌型号]）：能够在低温条件下对细胞进行离心操作，以收集菌体和去除上清液等。

3. 超净工作台：提供无菌操作环境，防止杂菌污染实验样品。

4. 恒温培养箱：用于培养干酪乳杆菌，控制培养温度在 37°C。

（四）干酪乳杆菌的培养与预处理

1. 将 - 80°C 保存的干酪乳杆菌甘油菌划线接种于 MRS 固体培养基平板上，37°C 培养 24 - 48 h，至长出单菌落。

2. 挑取单菌落接种至 5 mL MRS 液体培养基中，37°C、180 r/min 振荡培养过夜，获得种子液。

3. 以 1%（v/v）的接种量将种子液转接至 50 mL MRS 液体培养基中，继续培养至对数生长期中期（OD₆₀₀约为 0.4 - 0.6）。

4. 收集菌体：将培养好的菌液置于冰上预冷 10 min，然后在 4°C、5000 r/min 条件下离心 10 min，弃去上清液。

5. 细胞洗涤：用预冷的电击缓冲液重悬菌体，再次离心（4°C、5000 r/min、10 min），重复洗涤 2 - 3 次，以去除培养基残留成分对电转化的影响。

6. 细胞预处理：最后一次洗涤后，用适量的电击缓冲液重悬菌体，调整细胞浓度至约 1×10¹⁰ - 1×10¹¹ CFU/mL。对于部分实验组，在重悬时添加一定浓度的外源物质（如甘氨酸、氯化镁等），在冰上孵育 30 - 60 min，以改变细胞壁通透性，提高电转化效率。

（五）外源质粒的制备与定量

1. 采用碱裂解法提取外源质粒 [质粒名称]，具体操作步骤参照 [分子克隆实验指南等相关文献]。提取后的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整性，并使用核酸定量仪测定质粒浓度。

2. 将提取的质粒稀释至不同浓度梯度（如 1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL 等），备用。

（六）电转化实验

1. 取 100 μL 预处理后的菌体与不同体积（如 1 μL、5 μL、10 μL 等）和浓度的外源质粒混合，轻轻混匀后转移至预冷的电穿孔杯中（电极间距 0.2 cm）。

2. 将电穿孔杯置于电穿孔仪中，设置不同的电转化参数，包括电场强度（如 1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm 等）、脉冲时间（如 3 ms、5 ms、10 ms 等）和脉冲次数（一般为 1 - 3 次）。

3. 施加电击脉冲后，立即向电穿孔杯中加入 900 μL SOC 培养基，轻轻混匀，然后将菌液转移至 1.5 mL 无菌离心管中。

4. 37°C、180 r/min 振荡培养 2 - 3 h，使细胞复苏并表达质粒所携带的抗性基因。

（七）转化子的筛选与计数

1. 复苏培养后的菌液进行适当稀释（如 10⁻¹ - 10⁻⁶ 倍），取 100 μL 稀释后的菌液涂布于含有相应抗生素的 MRS 固体培养基平板上，37°C 培养 48 - 72 h，直至长出可见菌落。

2. 统计平板上的菌落数，并根据稀释倍数计算转化效率，公式为：转化效率（CFU/μg DNA）=(转化子菌落数 × 稀释倍数)/(质粒 DNA 加入量（μg）)。

（八）数据分析

三、结果与讨论

（一）电场强度对电转化效率的影响

（二）脉冲时间对电转化效率的影响

（三）质粒浓度对电转化效率的影响

（四）细胞预处理对电转化效率的影响

1. 甘氨酸预处理：在重悬菌体时添加不同浓度（0.5%、1.0%、2.0%）的甘氨酸，在冰上孵育 30 min 后进行电转化实验。结果表明，甘氨酸预处理能够显著提高电转化效率，其中 1.0% 甘氨酸处理组的转化效率最高，相比未处理组提高了约 [Z] 倍。甘氨酸能够削弱细胞壁中的肽聚糖交联，增加细胞壁的通透性，从而有利于外源质粒进入细胞。但甘氨酸浓度过高时，可能会导致细胞壁过度破坏，影响细胞的完整性和存活率，进而降低转化效率。

2. 氯化镁预处理：添加不同浓度（5 mM、10 mM、20 mM）的氯化镁进行细胞预处理，实验结果显示，10 mM 氯化镁处理组的电转化效率有所提高，比未处理组提高了约 [A]%。氯化镁可能通过影响细胞膜的稳定性和表面电荷分布，促进外源质粒与细胞膜的相互作用，从而提高转化效率。然而，过高浓度的氯化镁可能会引起细胞内渗透压的改变，对细胞产生不良影响。

（五）电转化条件的优化与验证

四、结论