本文构建了一种基于自动化膜片钳技术的高效率筛选体系，旨在检测上皮钠通道（ENaC）的激活剂与抑制剂，从而为新型ENaC调节剂的开发提供了有力的技术支撑。

研究背景

研究问题：上皮钠通道（ENaC）在多种上皮组织中对钠吸收起关键作用，并参与多种肾脏和肺部疾病的发生发展。因此，开发针对ENaC的药物具有重要的病理生理和治疗意义。然而，当前可用的ENaC调节剂种类稀少，且这些药物普遍存在特异性不足、副作用显著等缺陷。如何高效发现新型ENaC激活剂和抑制剂成为亟待解决的问题。

研究难点：ENaC的功能调控涉及复杂的蛋白水解加工机制，其激活与抑制依赖于特定的分子相互作用。尽管传统手动膜片钳技术被视为研究ENaC功能的权威方法，但其操作繁琐且耗时，难以胜任大规模药物筛选的重任。此外，ENaC的蛋白水解激活特性可能受到细胞分离和实验条件的影响，这为建立稳定的自动化记录系统带来了挑战。

文献综述：ENaC属于ENaC/退化素离子通道家族，是调节肾钠排泄、细胞外体积和血压的关键因子。已知醛固酮等多种激素和局部介质通过复杂机制调节ENaC活性，而ENaC功能异常与高血压、假性醛固酮减少症等疾病密切相关。既往研究显示，ENaC抑制剂（如阿米洛利、苯扎米尔、三氨蝶呤）虽具临床应用潜力，却面临结构高度相似、特异性不足及药代动力学局限。而ENaC激活剂（例如AP301、S3969）的研究，为优化肺部疾病中ENaC功能开辟了新途径。近年来，冷冻电镜技术，特别是单颗粒分析技术，解析ENaC结构的进展为开发新型靶向化合物提供了重要基础。然而，为了进一步加速药物发现进程，结合高通量筛选策略是至关重要的，它能够通过自动化、微型化和大规模数据分析，快速识别对特定生物靶标具有活性的化合物。

研究方法

细胞系与ENaC表达验证：研究使用了稳定转染人类αβγ-ENaC的HEK293细胞系（ENaC-HEK293），通过免疫印迹和手动全细胞膜片钳记录验证功能性表达。结果显示，ENaC-HEK293细胞中α亚基主要以完全裂解形式存在，而γ亚基则主要以未裂解形式存在。这解释了在手动膜片钳实验中观察到的显著（约十倍）胰凝乳蛋白酶刺激效应。

自动化膜片钳记录：研究采用TrypLE Express酶解法和柠檬酸钠非酶解法分离细胞，用于自动化膜片钳（APC）记录。TrypLE处理导致部分蛋白水解激活ENaC，而柠檬酸钠处理未引起蛋白水解激活。此外，通过延长悬浮培养时间，可减少蛋白水解激活比例，从而增强胰凝乳蛋白酶的相对刺激效应。

实验设计

细胞分离与恢复方案：为了提高ENaC激活剂检测分辨率，研究引入了细胞恢复方案。经过TrypLE处理后，细胞于37°C条件下在培养基中悬浮4小时，此过程旨在促进已内化裂解的ENaC的替换，使其被新插入的未裂解ENaC所替代。实验结果显示，经过恢复的细胞对胰凝乳蛋白酶的刺激响应显著增强，其电流值由-39.9 ± 0.4 pA提升至-62.1 ± 0.5 pA。

ENaC调节剂检测：本研究采用S3969作为ENaC的激活剂，同时选用γ-11肽和阿米洛利作为抑制剂，以此验证APC技术在识别ENaC调节剂方面的可行性与准确性。结果显示，S3969显著增加了向内电流（-28.9 ± 0.1 pA），而γ-11显著减少了向内电流（平均减少26.6 ± 0.2 pA）。阿米洛利的应用完全阻断了S3969的刺激效应，证实其由ENaC激活引起。

结果与分析

ENaC功能验证：手动膜片钳记录显示，ENaC-HEK293细胞基础电流较低，在胰凝乳蛋白酶作用下显著增加。胰凝乳蛋白酶使内向电流增加约十倍，表明转化未裂解或部分裂解γ-ENaC为完全裂解形式。阿米洛利的应用恢复了电流至初始水平，证实胰凝乳蛋白酶引起的内向电流增加是由于蛋白水解激活ENaC。

高通量筛选适用性：研究发现，TrypLE处理尽管会引发部分蛋白的水解激活，却非常适合高通量APC记录，其成功率高达75%。相比之下，柠檬酸钠处理尽管刺激效应更为显著，但其成功率却低于10%，因此并不适合高通量筛选。恢复方案不仅增强了胰凝乳蛋白酶的刺激效应，还确保了较高的记录成功率得以维持。

图2 表达人ENaC的HEK293细胞经酶解或非酶解分离后的自动膜片钳记录。a、b左图：使用多孔芯片（每孔4个孔，4×S型；Nanion，产品编号：22 2401）获得的TrypLE（a）或柠檬酸钠（b）细胞分离后代表性APC记录。背景颜色和标签表示不同浴液。测量起始于名义无钠溶液（[Na+] 0 mM），随后按方法所述进行溶液更换使[Na+]升至70 mM（[Na+] 70 mM）和105 mM（[Na+] 105 mM）。额外进行含105 mM Na+的细胞外溶液更换以确认电流达到平台期。绿色和紫色分别表示后续施加的糜蛋白酶（10 μg/ml，chymo）和阿米洛利（10 μM，ami）。右图：对应左图所示实验的汇总数据。电流水平通过取各溶液应用阶段最后5个数据点的平均值确定。箱线图显示中位数（粗横线）、第一和第三四分位数（箱体）、最小最大值（须线）（排除超出四分位距1.5倍的异常值）。双尾配对t检验（a：n=154，b：n=18）。c、d根据(a,b)数据计算的糜蛋白酶（c，ΔI糜蛋白酶）或后续阿米洛利（d，ΔI阿米洛利）对电流的绝对效应。数值通过从糜蛋白酶（c）或阿米洛利（d）存在时的电流值中减去施加前的电流水平获得。虚线表示零效应（无影响）。显示平均值±标准误及个体数据点。双尾t检验。e各实验组成功记录次数与总记录次数的比值。成功记录需满足：(i)封接电阻>50 MΩ，(ii)电流记录在测量期间稳定，(iii)阿米洛利抑制效应>5 pA。柱状图中白色数字表示各组成功记录次数。

图3 酶解细胞分离后的恢复期能增强糜蛋白酶对APC记录中ENaC电流的相对刺激作用。a、b左图：分别展示使用多孔芯片（每孔4孔，4×S型；Nanion产品编号：222401）在TrypLE处理后立即（a；无恢复期）或37℃完全培养基中恢复4小时后（b；含恢复期）获得的典型APC记录。背景色与标签标示的浴液条件同图2a、b。右图：对应左图实验的汇总数据。电流水平测定方法同图2a、b。采用双尾配对t检验（a：n=106，b：n=107）。c、d根据图2c、d所述方法，由a、b数据计算得出糜蛋白酶（c，ΔI糜蛋白酶）与后续施加的阿米洛利（d，ΔI阿米洛利）在无恢复（?）或有恢复（+）步骤细胞中所测电流的绝对效应。虚线表示零效应基准。数据以均值±标准误及个体数据点形式呈现。采用双尾t检验。e各实验组成功记录次数与总记录次数的比值，计算方法同图2e。白色柱内数字代表各组成功记录次数。

总体结论

协议优化：本研究确立了一种适用于高通量筛选的APC测量方法，能够可靠检测ENaC激活剂和抑制剂。通过TrypLE处理和细胞恢复方案，成功解决了ENaC部分蛋白水解激活的问题，提高了检测分辨率。

未来应用：研究结果为未来寻找新型ENaC调节剂提供了方法学基础，可能带来治疗高血压、囊性纤维化、肺水肿和呼吸窘迫等疾病的新疗法。特别是，细胞恢复方案为寻找模拟蛋白水解激活机制的调节剂提供了新思路。