超高分辨显微成像技术的概述

超分辨荧光成像技术突破了光学衍射极限，使在纳米尺度上观察活细胞内的亚细胞结构与动态行为成为可能，极大地推动了生命科学的进展。目前主流技术可分为三类：结构照明显微镜（SIM）、受激辐射损耗显微镜（STED）和单分子定位显微镜（SMLM，如PALM/STORM）。

技术原理：SIM通过在样品上投射结构化光条纹，利用莫尔条纹效应将样品的高频信息（精细结构）转换为可被探测器捕获的低频信息，再通过算法重建出高分辨率图像。可以将分辨率提升约两倍。其技术核心在于将空间频率混叠的信息进行解码。

图1：结构照明显微镜（SIM）的原理图

探针需求：SIM对探针的光物理性质要求相对宽松，但为了满足其快速、多帧采集的特点，并实现长时程活细胞成像，探针需要具备高亮度和强抗光漂白能力。

技术原理：STED使用一束激发光激发荧光分子，同时用一束环形的中空“损耗光”将激发光斑外围的荧光分子通过受激辐射过程“关闭”，从而有效压缩点扩散函数，获得超越衍射极限的分辨率。其分辨率与损耗光功率正相关，通常可达20-60 nm。

图2 JC-1探针检测细胞凋亡的流式图

探针需求：理想的STED探针需要极高的光稳定性以耐受强损耗光，同时要求高荧光亮度和大的斯托克斯位移，以方便激发光与损耗光的分离。

技术原理：SMLM（包括PALM和STORM）通过控制荧光团在“开”与“关”状态之间随机切换，使每次仅稀疏激活一部分分子。通过精确定位每个单分子的中心位置，并叠加数万帧图像，最终重建出一幅超分辨率图像。其定位精度可达纳米级，但成像速度较慢。

图3. FLICA（FL）caspase3/7与Live/Dead Near IR双染的流式图

探针要求：SMLM探针的核心要求是具备可控的光切换或光激活特性，并能在明暗态间循环多次，以提供足够多的定位点。