叶绿素荧光基础教程（含原声中字视频）

叶绿素荧光是评估植物光合作用功能的强大工具。想要正确理解叶绿素荧光信号，我们先来回顾光合作用的基础知识。只有植物、藻类和蓝细菌能够进行光合作用，它是地球上几乎所有生命的基础。光合作用产生氧气，这是众多生物生存所必需的。

植物细胞中绿色、呈球形的细胞器叫作叶绿体，光合作用就是在这些叶绿体内进行的。光合作用在空间上具有明确的分区。在叶绿体内部，类囊体膜是光反应的场所，水在此被氧化，电子经光合电子传递链传递并生成高能化合物。叶绿体内部存在由扁平囊状结构构成的膜网络，这些结构称为类囊体，是光反应的发生位点。类囊体中含有特殊的蛋白复合体，这些复合体结合了色素或铁、铜、锰等原子簇，能够吸收光能，并通过一系列氧化还原反应传递电子。

光合作用包含两个过程：光反应和碳固定。光反应发生在叶绿体的类囊体膜上，光能驱动水的氧化并释放氧气，电子经光合电子传递链传递，最终生成ATP和NADPH两种高能化合物。这两种物质会在碳固定过程中用于固定二氧化碳、合成糖类。而光反应的效率，可以通过叶绿素荧光来检测。最初，光能被天线复合体中的叶绿素吸收，并传递至反应中心。在反应中心，光能将电子激发，使其脱离原位并转移至受体分子，这一过程称为电荷分离。此时反应中心带正电荷，会吸引补充电子进入。

光合系统分为两类：光系统Ⅰ(PSI)和光系统Ⅱ(PSII)。在光系统Ⅱ中，补充电子来自其放氧复合体。该复合体能将水分子分解为氧气、质子和电子，质子被释放到类囊体腔中。光系统Ⅰ的电子则来自质体蓝素，而质体蓝素处于从光系统Ⅱ起始的有序电子传递链末端。电子在传递链中移动时，会将更多质子泵入类囊体腔，在类囊体膜两侧形成跨膜质子动力势，这一梯度被ATP合酶用于合成ATP。光系统Ⅰ产生的电子则将NADP?还原为NADPH。ATP和NADPH富含能量，为碳固定反应供能。

蓝色曲线代表叶绿素a的吸收光谱，它在蓝光区(约430 nm)和红光区(约660–680 nm)吸收最强，在绿光区吸收很弱，这也是叶片呈现绿色的原因。红色曲线代表叶绿素a的荧光发射光谱，叶绿素被激发后一小部分吸收的能量会以更长波长的光重新释放，主峰出现在685–690 nm附近。这些基本特征对叶绿素荧光研究至关重要，因为光系统Ⅱ的内周天线是叶绿素荧光的主要来源，荧光以红光和远红光形式发射。

叶绿素分子吸收光能后，获得能量到达激发态激发态的能量有三条去路：

1.传递给其他色素，最终到达反应中心，驱动光合作用

2.以热能形式耗散

3.以微弱荧光形式发射

光合作用利用能量或热能耗散效率的变化都会体现在荧光强度的改变上。因此，叶绿素荧光可作为一种无损手段，用于研究光合活性。现代叶绿素荧光仪可实现叶绿素荧光的定量测量。

WALZ公司提供适用于多种场景的叶绿素荧光仪，包括实验室研究、长期监测、水下测量及成像系统，可支持单点测量、悬浮液测量以及叶片和整株植物的空间分辨成像。这些系统均基于PAM技术，可对光合活性进行灵敏、定量的分析。PAM是Pulse Amplitude Modulation脉冲振幅调制的缩写。该方法只检测以特定频率调制的光信号，这种用于激发的调制光称为测量光。它与光合样品作用后，会诱导出对应频率的荧光信号，仪器直接提取并显示荧光振幅，但只选择性检测由调制测量光诱导的荧光。由连续光照产生的荧光，无论是环境太阳光，还是实验中的作用光不会被系统直接检测。探测器锁定调制测量脉冲的特定频率，只提取对应的荧光组分。因此，PAM信号只反映光系统Ⅱ光化学状态的变化，因为这些变化会影响调制荧光的振幅。这种高选择性使得光系统Ⅱ的检测可在各种环境光照下进行，包括全日照环境。

评估光系统Ⅱ活性常用的方法是饱和脉冲法。持续施加极微弱的调制测量光：强度足以诱导叶绿素荧光，但不足以驱动实质性光合作用。在此条件下，光系统Ⅱ反应中心保持开放状态。施加短时高强度饱和脉冲可瞬间关闭所有光系统Ⅱ反应中心，使原初电子受体QA完全还原，电子传递链被电子充满。此时，电荷分离几乎停止，荧光上升至最大值。由于电子传递暂时受阻，激发能无法用于光化学反应，转而以荧光形式释放。利用这些荧光水平，可计算出描述光系统Ⅱ效率和能量耗散的关键参数。

在实际测量中，荧光测量通常采用几个标准荧光水平进行描述。这些水平可用于评估多种参数，例如光化学反应效率，或抵御过量光照的保护程度。

下面视频将分步介绍一次典型的PAM饱和脉冲实验，实验分为诱导期和恢复期。样品先进行暗适应，确保所有光系统Ⅱ反应中心完全开放，即光系统Ⅱ的电子受体处于氧化态，可接收反应中心的电子，同时碳固定相关酶失活，所有淬灭荧光的强光保护机制完全松弛。这一过程通常需要10–30分钟，必要时可延长。暗适应为实验提供了明确的基准状态，开启微弱调制测量光，记录此时的荧光值，即最小荧光Fo。Fo代表光系统Ⅱ原初受体QA处于氧化态，所有反应中心开放时的荧光强度，是后续饱和脉冲步骤的参考点。随后施加短时高强度饱和脉冲，瞬间关闭所有光系统Ⅱ反应中心，QA完全还原，电子传递链充满电子。电荷分离大幅减慢，荧光上升至最大水平。由于电子传递暂时受阻，激发能无法用于光化学反应，只能以荧光形式释放。脉冲结束后，电子传递恢复，反应中心重新开放，荧光迅速回落至基线。通过第一次饱和脉冲，可得到：最小荧光Fo，最大荧光Fm，二者共同定义了暗适应状态下的荧光范围。两者之差称为可变荧光Fv：Fv=Fm?FoF?/F?是衡量暗适应样品光系统Ⅱ最大量子效率的常用指标。对多数植物而言，健康、无胁迫的叶片，该值通常在0.79–0.84左右。Fv/Fm降低，通常表明发生了光抑制或存在影响光系统Ⅱ的其他生理胁迫。

为研究植物对光的适应，开启特定强度的光化光以驱动光合作用，在光化光照射期间反复施加饱和脉冲，可追踪荧光变化，定量分析植物体内随时间发生的各类淬灭过程。在光适应状态下：每次饱和脉冲达到的最大荧光记为 Fm′，脉冲施加前的稳态荧光记为F(或Fs)。利用每一组F和Fm′可计算光系统Ⅱ实际量子效率(Y(II)=(Fm’-F)/Fm’)。荧光曲线的变化反映了植物对光照的适应过程。持续光照下并非所有激发能都能用于光化学反应，植物会启动保护机制，将多余能量以热能形式安全耗散，这种受调控的能量耗散称为非光化学淬灭NPQ。在诱导期，NPQ通常随样品适应光照而升高，当光化学反应与能量耗散达到新平衡时，荧光信号最终趋于稳态。NPQ通过比较暗适应下的最大荧光Fm与光下的最大荧光Fm′计算得出(NPQ =Fm/Fm’-1)。关闭光化光后样品在暗中逐渐恢复，非光化学淬灭松弛，光合机构回到光照前状态。通过继续施加饱和脉冲可跟踪这一去淬灭过程，定量分析弛豫动力学。

综上所述，叶绿素荧光测量是在实验室和野外研究光合作用的通用、高效工具。

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