在化学发光试剂的开发过程中,建立一套高效的偶联工艺体系是免疫测定成功的关键基础。偶联工艺的优化不仅可以提高抗体或其他配体的结合效率,还能有效减少非特异性结合,提升检测结果的准确性和可靠性。
我们针对甲苯磺酰基磁珠设计并开发了一套与之匹配的偶联工艺,并对关键环节进行了优化,例如,通过调整反应温度、pH值、反应时间等条件,最大限度地促进抗体或其他配体与磁珠表面的共价结合,提升偶联效率,助力下游客户开发出高效精准的化学发光检测试剂。
Tosyl磁珠标记原理
甲苯磺酰基(Tosyl)磁珠表面具有亲水性聚合物涂层,其中的甲苯磺酰基(疏水基团)提供了反应性磺酰基,可以通过化学键合的方式将含有氨基或硫基的抗体或其他配体共价连接到磁珠表面。
在反应过程中,抗体首先会通过物理吸附附着在磁珠上,随后发生化学结合,通常磁珠偶联物的制备应在37℃下反应18-24小时。随着化学结合的进行,甲苯磺酰基逐渐脱离,磁珠表面的亲水性增加,从而维持磁珠表面偶联物的生物活性,并有助于减少非特异反应【1】。
图1. 甲苯磺酰基磁珠标记原理
Tosyl磁珠标记工艺
关键点 KEY POINT
01
催化剂
在催化剂体系中添加硫酸铵是为了增强蛋白质的疏水性,促使其疏水基团暴露,从而更好地与Tosyl基团接近。然而过量的硫酸铵可能会导致抗体变性,因此对于不同的项目,需要单独评估硫酸铵的最适添加量。对于疏水性较强的蛋白,可以考虑选择不添加硫酸铵。
02
pH
Tosyl基团和氨基的反应需要在中性偏碱的条件下进行。通常,IgG的等电点(pI)为8.0,在pH值略高于抗体等电点的环境中,有助于蛋白质疏水基团的暴露。同时,蛋白质带负电荷,可以通过静电吸附增强蛋白质与磁珠的结合。
03
偶联时间
延长偶联时间有助于确保更高的反应效率。在偶联过程中,随着时间的增加,反应性会逐步提高。一般来说,当偶联时间超过16小时后,反应性会趋于平稳,因此我们建议偶联时间在16h-24h比较合适。
图2. 偶联时间对反应性的影响
04
封闭时间
延长封闭时间通常能有效提高封闭效果,减少非特异性吸附,从而降低本底信号,提升信噪比。因此,选择合适的封闭时间对控制本底信号至关重要。通过梯度测试发现,当封闭时间超过16小时后,本底信号趋于稳定。因此,Tosyl磁珠的封闭时间较长,建议进行过夜封闭。
图3. 封闭时间对本底的影响
Tosyl磁珠使用中的注意事项
01
物理吸附对试剂长期稳定性的影响
在Tosyl磁珠与抗体的偶联反应完成后,部分抗体会通过物理吸附附着在磁珠表面,这些通过物理吸附的抗体可能会因吸附平衡而逐渐脱落,进而对试剂的长期保存稳定性产生负面影晌。
为减少物理吸附的抗体,可采取以下措施:延长反应时间、提高反应温度、添加反应液催化剂(如硫酸铵或硫酸钠)、或者通过添加过量的封闭剂 (如BSA)进行置换,以优化偶联效果。
02
磁珠聚集现象
Tosyl磁珠表面含有甲苯磺酰基基团,属于疏水性磁珠,易发生团聚。在目前的包被方法中,Tosyl磁珠的包被液通常使用硼酸体系,反应促进剂为硫酸铵。
Tosyl磁珠与羧基磁珠偶联流程对比
在化学发光试剂的开发过程中,Tosyl磁珠和羧基磁珠是两种常用的磁珠类型,广泛应用于各种免疫检测技术。相比于羧基磁珠,Tosyl磁珠的偶联过程无需使用额外的EDC/NHS活化剂,显著地简化了实验步骤,减少了操作的复杂性,因而在操作简便性方面具有明显优势。
为了帮助客户更好地选择适合其开发需求的磁珠类型,我们对羧基磁珠和Tosyl磁珠在使用过程中的差异进行了全面对比分析,从偶联效率、操作简便性和应用场景等多个维度提供了参考。
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参考文献
1. Otieno, Brunah A., C. E. Krause, and J. F. Rusling. "Bioconjugation of antibodies and enzyme labels onto magnetic beads." Methods in enzymology. Vol. 571. Academic Press, 2016. 135-150.
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