大鼠叉头框蛋白01(FoxO1)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　大鼠叉头框蛋白01(FoxO1)ELISA试剂盒实验使用说明书

　　BS-0308  人叉头框蛋白01(FoxO1)ELISA试剂盒  48T/96T

　　一、实验原理

　　本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法(ELISA)。将纯化的大鼠FoxO1抗体包被于微孔板中，形成固相抗体。加入样本后，样本中的FoxO1与固相抗体结合。随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，形成“固相抗体-抗原-酶标抗体”复合物。经过彻底洗涤去除未结合物质后，加入底物TMB显色。TMB在HRP催化下转化为蓝色，并在酸作用下变为黄色。颜色的深浅与样本中FoxO1浓度呈正相关，通过酶标仪在450nm波长测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。

　　二、试剂盒组成

　　预包被抗体的96孔板

　　FoxO1标准品(2瓶)

　　标准品稀释液(1×20mL)

　　检测溶液A(HRP标记抗体，1×120μL)

　　检测溶液B(生物素标记抗体，1×120μL)

　　检测稀释液A/B(各1×12mL)

　　TMB底物(1×9mL)

　　终止液(1×6mL)

　　浓洗涤液(30×，1×20mL)

　　说明书

　　三、样本处理

　　1. 血清样本

　　采集全血于血清分离管，室温静置2小时或4℃过夜。

　　1000×g离心20分钟，取上清。

　　上清可立即检测，或分装后-20℃/-80℃保存，避免反复冻融‌。

　　2. 血浆样本

　　使用EDTA或肝素抗凝，采集后30分钟内2-8℃、1000×g离心15分钟。

　　取上清检测或保存，避免反复冻融。

　　3. 组织匀浆

　　用预冷PBS(0.01M, pH7.4)冲洗组织，去除残留血液。

　　称重后剪碎，按1:9重量体积比加入PBS。

　　冰上充分研磨，超声破碎或反复冻融裂解细胞。

　　5000×g离心5-10分钟，取上清检测。

　　4. 细胞培养上清

　　直接离心取上清，避免细胞碎片干扰。

　　注意事项

　　样本避免使用NaN3防腐剂，因其HRP活性。

　　细胞裂解液或化学裂解液制备的样本可能引入干扰物质，需谨慎处理‌。

　　四、操作步骤

　　1. 试剂准备

　　所有试剂使用前平衡至室温(20-25℃)。

　　浓洗涤液用蒸馏水稀释30倍(1份浓液+29份水)。

　　2. 加样

　　从铝箔袋中取出所需板条，剩余板条密封放回4℃。

　　设标准品孔(10孔)：依次加入不同浓度标准品50μL，梯度稀释(如100μL原液+50μL稀释液混匀后取100μL至下一孔)。

　　样本孔：加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL。

　　空白孔：不加样本。

　　37℃孵育60分钟。

　　3. 洗涤

　　弃去孔内液体，吸水纸拍干。

　　每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，重复5次(可用洗板机)。

　　4. 加酶标抗体

　　每孔加入HRP标记检测抗体100μL(空白孔除外)。

　　37℃孵育60分钟，洗涤5次。

　　5. 显色与终止

　　每孔加底物A、B各50μL，37℃避光孵育15分钟。

　　每孔加终止液50μL，终止反应(蓝色变黄色)。

　　6. 测定

　　15分钟内，用450nm波长酶标仪测定各孔OD值。

　　五、结果计算

　　以标准品浓度(ng/mL)为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。

　　根据样本OD值，通过标准曲线计算FoxO1浓度。

　　六、注意事项

　　试剂保存‌：未开封试剂盒按标签温度保存;开封后酶标板加干燥剂密封-20℃保存，剩余试剂1个月内用完。

　　操作规范‌：

　　避免底物A挥发、底物B见光，操作时戴手套。

　　加样顺序一致，确保温育时间统一。

　　洗涤彻底，避免交叉污染。

　　样本处理‌：

　　组织匀浆避免红细胞残留，影响结果准确性。

　　细胞上清样本需评估细胞状态和采样时间‌。

　　局限性‌：本试剂盒仅供科研使用，不可用于临床诊断。

　　七、性能参数

　　检测范围‌：0.313-20 ng/mL。

　　灵敏度‌：低检测浓度0.16 ng/mL。

　　线性范围‌：样本稀释后线性回归与预期浓度相关系数R值≥0.990。

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