人凝血因子Ⅲ(FⅢ)ELISA试剂盒实验使用说明书

   人凝血因子Ⅲ(FⅢ)ELISA试剂盒实验使用说明书

   BS-0927人凝血因子Ⅲ(FⅢ)ELISA试剂盒

   一、实验原理

   本试剂盒采用‌双抗体夹心法‌检测人血清或血浆中的凝血因子Ⅲ（FⅢ）浓度。

   包被抗体‌：微孔板孔内预包被抗人FⅢ单克隆抗体，捕获样本中的FⅢ。

   检测抗体‌：加入HRP标记的抗人FⅢ多克隆抗体，与捕获的FⅢ形成“抗体-抗原-酶标抗体”复合物。

   显色反应‌：加入TMB底物液，HRP催化反应生成蓝色产物，终止液（2M溶液）终止后变黄，450nm波长测定吸光度（OD值），浓度与OD值正相关。

   二、试剂盒组成

   组分规格/数量保存条件

   预包被微孔板96孔（可拆）2-8℃密封保存

   FⅢ标准品冻干粉，2瓶-20℃长期保存

   标准品稀释液1.5mL×1瓶2-8℃

   HRP标记检测抗体6mL×1瓶2-8℃避光

   TMB底物液A液+B液各3mL2-8℃避光

   20×洗涤缓冲液20mL×1瓶室温

   终止液（2M溶液）6mL×1瓶室温

   封板膜2张室温

   注‌：所有试剂使用前需平衡至室温（20-25℃），避免反复冻融。

   三、样本处理

   血清‌：

   血液室温静置10-20分钟，1000×g离心10分钟分离血清。

   避免溶血，分装后-20℃保存，避免反复冻融。

   血浆‌：

   使用EDTA或肝素抗凝，离心后取上清。

   保存同血清，但需注意抗凝剂可能干扰检测（建议预实验验证）。

   四、实验步骤

   加样‌：

   标准品梯度稀释（如80、40、20、10、5、2.5U/L），每孔加100μL。

   样本孔加100μL待测样本，空白孔加稀释液。

   37℃孵育90分钟，洗板5次（每次拍干）。

   检测‌：

   每孔加100μLHRP标记抗体，37℃孵育60分钟，洗板。

   加100μLTMB底物，避光显色15分钟，立即加50μL终止液。

   读数‌：

   450nm波长测OD值，空白孔调零。

   绘制标准曲线（OD值vs.浓度），样本浓度通过曲线计算。

   五、注意事项

   试剂保存‌：未开封试剂盒2-8℃保存6个月，开封后组分需密封防潮。

   操作规范‌：

   加样时间控制在5分钟内，避免气泡。

   洗涤需彻底，拍干孔内液体，防止交叉污染。

   安全防护‌：

   终止液具腐蚀性，操作时戴手套，溅到皮肤立即冲洗。

   底物液避光保存，显色后立即读数。

   六、常见问题处理

   问题现象可能原因解决方案

   高背景/假阳性洗板不充分、试剂污染增加洗涤次数，更换新试剂

   无显色信号酶失活、漏加底物检查试剂有效期，复核操作步骤

   样本值异常溶血、反复冻融重新采集样本，避免冻融

   七、质控要求

   标准曲线‌：R²≥0.99，线性范围覆盖样本预期浓度。

   回收率‌：80%-120%（通过加标实验验证）。

   精密度‌：板内CV<10%，板间CV<15%。

   提示‌：实验前建议阅读完整说明书，并预实验验证样本稀释倍数。

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