Th细胞简介
Th细胞（辅助性T细胞）是由初始CD4? T细胞活化后分化形成的功能性免疫细胞，表面表达CD4分子，需通过T细胞受体识别抗原呈递细胞呈递的MHC-Ⅱ类抗原肽复合物启动活化，是免疫系统的“指挥中枢”。它能分化为Th1、Th2、Th17等多个功能亚群通过分泌特异性细胞因子、直接接触等方式，辅助B细胞产生抗体、增强细胞毒性T细胞的杀伤能力、激活巨噬细胞，同时协调免疫细胞间的相互作用，维持免疫平衡，广泛参与抗病原体感染、炎症反应、免疫调节等过程，其亚群失衡可能引发过敏、自身免疫病等免疫相关疾病。
Th亚群及其分化调控通路
初始CD4? T细胞经T细胞受体（TCR）刺激后，在不同细胞因子和共刺激信号的作用下，可分化为多种不同的效应性辅助性T细胞（Th）亚群。
图1. Cytokine signalings regulate CD4+ Th cell differentiation[1]
Th1细胞
功能定位：Th1细胞通过分泌IFN-γ，参与抵御胞内细菌和病毒的免疫防御。
关键分化因子：IL-12和IFN-γ是Th1细胞分化不可或缺的两种细胞因子。
核心调控机制：TCR刺激与IFN-γ-STAT1信号诱导转录因子T-bet表达，T-bet既驱动Th1分化，又抑制Th2/Th17分化。
反馈环路：T-bet可促进IFN-γ和IL-12Rβ2表达，IL-12通过STAT4信号维持T-bet表达，形成正向反馈，助力Th1分化。
Th2细胞
核心标志物：Th2细胞的核心标志物是转录因子GATA-3和细胞因子IL-4、IL-5、IL-13。
功能：抗蠕虫感染、促组织修复，同时与哮喘、过敏等慢性炎症相关。
分化核心通路：IL-4（外源分泌或自分泌）结合CD4? T细胞的IL-4R，通过STAT6磷酸化诱导GATA-3表达，推动Th2
关细胞因子产生；TCF-1（TCR激活）、STAT5（IL-2启动）及NFAT1等转录因子协同促进分化。
调控平衡机制：GATA-3通过沉默Th1相关基因抑制其发育，形成Th1/Th2分化的相互制衡。
Th9细胞
细胞定位与功能：Th9细胞是新型CD4? T细胞亚群，广泛参与感染、过敏、癌症、自身免疫等多种病理生理过程。
分化诱导条件：体外需“TCR刺激+ IL-4 + TGF-β”共同诱导，核心标志物为IL-9（高表达）及转录因子IRF4、PU.1。
核心调控机制：IL-4介导的STAT6磷酸化与TGF-β激活Smad（Smad2/3）、PU.1和IRF8，协同激活关键转录因子，形成转录因子复合物调控IL-9基因表达；STAT5信号、共刺激信号及多种辅助细胞因子（IL-1、IL-25、IL-7、IL-21）共同参与分化调控。
Th17细胞
细胞特征与功能：核心标志物为转录因子RORγt和细胞因子IL-17A-F，IL-21，IL-10，IL-23，IL-22等，核心功能是抵御黏膜部位胞外病原体，同时关联慢性炎症与自身免疫病。
分化与稳定通路：IL-6 + TGF-β为分化启动信号，经STAT3-RORγt轴驱动Th17细胞形成；自分泌IL-21和外源IL-23通过持续激活STAT3，维持细胞谱系稳定性。
可塑性特征：TGF-β与IL-6共同诱导产生“经典型”Th17细胞，其特征是分泌IL-17、IL-21和IL-10；而IL-6、IL-1β与IL-23则诱导产生“致病性”Th17细胞，该亚型高表达IFN-γ、GM-CSF和IL-22。
转录因子调控网络：RORγt为核心，IRF4/BATF复合物、Runx1及RORα等多种转录因子协同作用，调控Th17相关基因表达并抑制Foxp3。
Tfh细胞
细胞特征与功能：Tfh细胞以高表达PD-1、CXCR5、ICOS及转录因子Bcl-6为核心标志，核心功能是辅助B细胞活化，推动生发中心形成和高亲和力抗体产生，调控体液免疫应答。
核心调控转录因子：Bcl-6是Tfh细胞发育的关键转录因子，通过抑制其他Th亚群的谱系转录因子（T-bet、GATA-3等）和Blimp-1，维持Tfh细胞特性；TCF-1、BATF等多种转录因子协同参与调控。
信号与细胞因子调控：共刺激信号中，ICOS促进Tfh分化，CD28通过激活ERK通路抑制Tfh细胞分化；细胞因子方面，IL-6和IL-21分别通过激活STAT3和诱导Bcl-6表达，促进Tfh细胞分化；而IL-2/STAT5信号通路则通过诱导Blimp-1表达，强烈抑制Tfh细胞发育。
Treg细胞
细胞特征与功能：核心标志物为CD25、Foxp3及抑制性细胞因子（IL-10，TGF-β，IL-35等），核心功能是抑制异常免疫应答，维持免疫耐受。
主要亚型与起源：分为胸腺发育的tTreg和外周诱导的iTreg，后者需抗原刺激及TGF-β、IL-2共同诱导。
Foxp3调控机制：转录层面受多重信号调控，TCR/CD28刺激激活NF-κB等因子，TGF-β激活Smad2/3及FoxO家族，IL-2通过STAT5通路，均能促进Foxp3表达；同时涉及表观遗传调控。
小鼠Th细胞亚群分化方案
实验准备
动物：选用5-10周龄C57BL/6雌性小鼠（初始T细胞比例更高）。
仪器、耗材与试剂准备
1）核心仪器：无菌细胞培养超净工作台、37℃/5%CO?培养箱、流式细胞分选仪、高速磁性细胞分选系统、离心机、光学显微镜。
2）耗材：48/24孔培养板、60 mm培养皿、15 mL离心管、无菌解剖工具（剪刀、镊子）、解剖针、2 cm × 2 cm尼龙网（120 μm孔径）、3-10 mL注射器、流式专用管/收集管。
3）关键试剂：
●基础液：无菌PBS、PBS+1% FBS（PBS+）、完全RPMI培养基（可替换为IMDM、DMEM）、流式细胞术（FACS）缓冲液（含1 mM EDTA，pH8.0，1% BSA的PBS，无菌过滤）。
●抗体与磁珠：抗CD3抗体、抗CD28抗体，CD4磁珠，细胞内细胞因子检测抗体（如IFN-γ、IL-4、IL-17、Foxp3）。
●分化相关因子：hIL-2、rmIL-12、rmIL-4、hTGF-β、rmIL-6、rmIL-21、rmIL-23，封闭抗体（抗IL-4抗体、抗IFN-γ抗体）。
●辅助试剂：1×ACK红细胞裂解液、70%乙醇、石蜡膜、高尔基体抑制剂、PMA、Ionomycin。
预包被培养板
1)用无菌PBS稀释抗CD3和抗CD28抗体，包被48/24孔板：
●Th0、Th1、Th2、iTreg：两者均为1 μg/mL，48孔板每孔0.5-1 mL。
●Th17：抗CD3抗体2 μg/mL+抗CD28抗体1 μg/mL（高浓度抗CD3抗体更利于Th17分化）。
2)包被后封口防蒸发污染，4℃孵育过夜或37℃孵育1小时，使用前用无菌PBS洗涤1次。
小鼠淋巴器官分离
选用5-10周龄C57BL/6雌性小鼠，用70%乙醇喷雾消毒体表。
固定小鼠，纵向剪开皮肤，避免刺破深层组织，用镊子撑开皮肤并固定，将获取的淋巴结，放入收集培养皿中。
剪开腹膜取出脾脏，同样放入收集培养皿中。
组织处理与细胞悬液制备
淋巴结与脾脏分别处理：将组织置于铺有尼龙网的60 mm培养皿中，用注射器推杆碾压或磨砂载玻片研磨，使细胞悬浮。
反复吹吸悬液打散团块，通过尼龙网过滤至15 mL离心管，补加PBS+至满管，4℃、475×g离心5分钟。
脾脏细胞：弃上清，用1 mL冰浴1×ACK裂解液重悬沉淀，裂解1分钟后缓慢加入10 mL PBS+，倒置离心管混匀，离心洗涤；淋巴结细胞直接用2 mL PBS+重悬。
若混合样本，将淋巴结细胞悬液加入脾脏细胞悬液，4℃下475×g再次离心5分钟。
CD4? T细胞富集
用CD4磁珠标记细胞：每只小鼠组织样本加15 μL磁珠+ 85 μL PBS+，4℃孵育15-30分钟。
10 mL PBS+洗涤后过滤除杂，离心收集沉淀，用100 μL PBS+重悬，通过高速磁性分选系统进行阳性分选。
收集阳性组分，PBS+洗涤后备用，可提高后续分选效率和产量。
初始CD4? T细胞分选
用含CD62L、CD44、CD25、CD4的荧光抗体混合液（每只小鼠样本100 μL）重悬细胞沉淀，4℃避光孵育15-30分钟。
PBS+洗涤离心，过滤后移入流式专用管，冰上避光保存至分选。
分选CD4?CD25?CD62L?CD44?表型的初始CD4? T细胞，收集管底部预先加入1-2 mL完全RPMI或FBS。
分选后用完全RPMI洗涤细胞，计数并调整浓度至1×10?个/mL。
体外定向分化诱导
细胞接种
吸弃抗CD3和抗CD28包被板的孔内液体，每孔用1mL无菌PBS洗涤一次。
48孔板：每孔加入0.5 mL完全RPMI培养基，接种0.5×10?个初始CD4? T细胞。
24孔板：每孔加入1.0 mL完全RPMI培养基，接种1×10?个初始CD4? T细胞。
各亚群分化因子添加
按以下配方补充细胞因子和封闭抗体，若检测药物等因子，可根据实验设计在分化前/中/后加入：
培养条件
常规培养：37℃、5% CO?环境中培养4-5天，随后进行基因表达和细胞因子检测。
延长培养：培养2天后去除TCR刺激，用含10 U/mL IL-2的新鲜培养基调整浓度至1×10?个/mL，接种到未包被孔中，以促进细胞增殖并提高最终产量。
分化效果检测
流式细胞术检测细胞因子
1）用10 ng/mL PMA+1000 ng/mL Ionomycin或1 μg/mL抗CD3抗体，在高尔基体抑制剂存在下刺激细胞4-6小时。
2）进行细胞内细胞因子染色，检测各亚群特征因子（Th1→IFN-γ、Th2→IL-4、Th17→IL-17），同时染色非谱系因子作为阴性对照。Th17培养需额外检测Foxp3，排除Treg反向分化干扰。
ELISA检测细胞因子
1）收集培养上清液，通过细胞因子特异性ELISA试剂盒检测目标蛋白含量。
2）若担心增殖差异影响结果，可洗涤细胞并计数归一化后，用1μg/mL抗CD3抗体刺激24小时再收集上清；检测Th2的IL-4时需先洗涤去除初始培养残留的IL-4。
实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）检测基因表达
1)收集细胞洗涤后归一化，用1 μg/mL抗CD3抗体刺激2-6小时，提取mRNA。
2)检测各亚群特征基因（Th1→T-bet/Ifng、Th2→GATA3/Il4、Th17→RORγt/Il17、iTreg→Foxp3）的表达水平。
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图2. Recombinant Human IL-2 stimulates proliferation of CTLL-2 cells. The specific activity is ≥ 1 × 107 IU/mg.
Bioactivity of Mouse IL-21
图3. Measured by its ability to enhance IFN-gamma secretion in NK-92 human natural killer lymphoma cells. The EC50 for this effect is 0.2-2.3 ng/mL.
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