多聚赖氨酸硅纳米制备及转染实验研究

一、引言

在现代生物医学研究领域，基因治疗作为一种极具潜力的治疗手段受到了广泛关注。基因治疗的关键在于高效、安全的基因传递载体，能够将治疗性基因准确地递送至靶细胞并实现有效的表达。传统的病毒载体虽然转染效率较高，但存在免疫原性、潜在致癌性等安全隐患。因此，非病毒载体的研发成为了当前研究的热点。

纳米材料由于其独特的物理化学性质，如小尺寸效应、表面效应等，在基因传递领域展现出巨大的应用潜力。其中，硅纳米材料因其良好的生物相容性、易于表面修饰等优点而备受青睐。多聚赖氨酸（PLL）作为一种阳离子聚合物，具有与核酸分子静电相互作用的能力，可有效压缩和保护核酸。将多聚赖氨酸与硅纳米材料结合，有望制备出一种新型的高效、低毒的基因转染载体。本研究旨在制备多聚赖氨酸硅纳米（PLL - SiNPs），并对其转染性能进行深入研究。

二、材料与方法

（一）材料

正硅酸乙酯（TEOS）、氨水（NH₃・H₂O）、多聚赖氨酸（PLL，不同分子量）、荧光标记的 DNA（F - DNA）、细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、3 - （4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基） - 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐（MTT）等。实验所用细胞系包括 HeLa 细胞和 293T 细胞。

（二）多聚赖氨酸硅纳米（PLL - SiNPs）的制备

硅纳米颗粒（SiNPs）的合成
在乙醇 - 水混合溶液中，以氨水为催化剂，通过正硅酸乙酯（TEOS）的水解和缩聚反应制备硅纳米颗粒。具体步骤如下：将一定量的乙醇、水和氨水混合均匀，在剧烈搅拌下缓慢滴加 TEOS。反应在室温下持续一定时间后，通过离心收集生成的 SiNPs，并用乙醇多次洗涤以去除杂质，最后将 SiNPs 分散在去离子水中备用。

多聚赖氨酸修饰硅纳米颗粒（PLL - SiNPs）的制备
将合成的 SiNPs 分散液与不同浓度的多聚赖氨酸溶液混合，在特定的 pH 和温度条件下反应一定时间。反应过程中，多聚赖氨酸通过静电作用和化学键合（如氨基与硅羟基之间的反应）等方式结合到硅纳米颗粒表面。反应结束后，通过离心和透析等方法去除未结合的多聚赖氨酸，得到 PLL - SiNPs 分散液。

（三）PLL - SiNPs 的表征

粒径和 zeta 电位测定
使用动态光散射仪（DLS）测量 PLL - SiNPs 的粒径大小和粒径分布，同时测定其 zeta 电位，以评估其表面电荷性质。

形态观察
通过透射电子显微镜（TEM）观察 PLL - SiNPs 的微观形态，包括颗粒的形状、大小和分散情况。

傅里叶变换红外光谱（FT - IR）分析
采用 FT - IR 光谱仪对 PLL - SiNPs 进行分析，通过对比 SiNPs 和 PLL - SiNPs 的红外光谱，确定多聚赖氨酸与硅纳米颗粒之间的化学键合情况。

（四）细胞培养与转染实验

细胞培养
将 HeLa 细胞和 293T 细胞分别接种于含有适量胎牛血清和抗生素的 DMEM 培养基中，在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养。当细胞生长至合适密度时，进行传代培养。

转染实验
将不同浓度的 PLL - SiNPs 与荧光标记的 DNA（F - DNA）混合，在特定条件下孵育一定时间，形成 PLL - SiNPs/F - DNA 复合物。然后将复合物加入到培养的细胞中，继续培养一定时间。转染结束后，使用荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，以评估转染效率。同时，设置不同的对照组，如仅加 DNA 组、仅加 PLL - SiNPs 组、阳性对照组（使用已知转染试剂）等。

（五）细胞毒性评估

采用 MTT 法评估 PLL - SiNPs 的细胞毒性。将不同浓度的 PLL - SiNPs 加入到培养的细胞中，培养一定时间后，加入 MTT 溶液继续培养。然后去除上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）溶解结晶物，使用酶标仪测定吸光度值。根据吸光度值计算细胞存活率，以评估 PLL - SiNPs 对细胞的毒性作用。

三、结果与讨论

（一）PLL - SiNPs 的表征结果

粒径和 zeta 电位
DLS 测量结果显示，制备的 PLL - SiNPs 粒径分布较为均匀，平均粒径在一定范围内（具体数值根据实验数据）。zeta 电位分析表明，PLL - SiNPs 表面带有正电荷，这有利于其与带负电荷的 DNA 之间的静电相互作用。随着多聚赖氨酸修饰量的增加，粒径略有增大，zeta 电位也相应升高，这与多聚赖氨酸的结合情况相符。

形态观察
TEM 图像显示，PLL - SiNPs 呈球形，分散良好，无明显团聚现象。纳米颗粒的尺寸与 DLS 测量结果基本一致，表面较为光滑，说明多聚赖氨酸的修饰并未对硅纳米颗粒的形态产生显著影响。

FT - IR 分析
FT - IR 光谱结果显示，PLL - SiNPs 在特定波数处出现了多聚赖氨酸的特征吸收峰，与纯多聚赖氨酸和 SiNPs 的光谱相比，证实了多聚赖氨酸成功修饰到硅纳米颗粒表面。同时，一些化学键的变化也表明了两者之间存在化学键合作用，这为 PLL - SiNPs 的稳定性提供了保障。

（二）转染效率评估

荧光显微镜观察结果表明，PLL - SiNPs/F - DNA 复合物能够有效地将荧光标记的 DNA 递送至细胞内。在一定浓度范围内，转染效率随着 PLL - SiNPs 浓度的增加而升高。与对照组相比，PLL - SiNPs 表现出较高的转染效率，尤其在优化的实验条件下，其转染效率接近甚至在某些细胞系中超过了阳性对照组的转染试剂。不同细胞系对 PLL - SiNPs 的转染效率有所差异，这可能与细胞的类型、膜表面性质等因素有关。

（三）细胞毒性分析

MTT 法测定的细胞存活率结果显示，在较低浓度下，PLL - SiNPs 对 HeLa 细胞和 293T 细胞的毒性较低，细胞存活率较高。随着 PLL - SiNPs 浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，但在一定浓度范围内仍保持在可接受的水平。与传统的转染试剂相比，PLL - SiNPs 在相同转染效率下表现出更低的细胞毒性，这表明其在生物医学应用中的安全性优势。

四、结论

本研究成功制备了多聚赖氨酸硅纳米（PLL - SiNPs），并对其物理化学性质、转染效率和细胞毒性进行了全面研究。结果表明，所制备的 PLL - SiNPs 具有合适的粒径、正表面电荷和良好的稳定性。在细胞转染实验中，PLL - SiNPs 表现出较高的转染效率和较低的细胞毒性，在基因治疗和生物医学领域具有广阔的应用前景。然而，进一步的研究仍需优化其制备工艺，提高转染效率，降低细胞毒性，并深入探究其在体内的生物分布、代谢等情况，为其临床应用奠定更坚实的基础。同时，本研究为新型基因转染载体的研发提供了新的思路和方法，有望推动基因治疗技术的发展。

在未来的研究中，可以考虑对多聚赖氨酸的分子量、硅纳米颗粒的尺寸等参数进行更精细的调控，以进一步优化 PLL - SiNPs 的性能。此外，还可以探索与其他功能分子或材料的联合应用，赋予 PLL - SiNPs 更多的功能，如靶向性、可降解性等，从而更好地满足基因治疗的复杂需求。