酵母双杂交筛选HSPC016互作蛋白

摘要

研究基于酵母双杂交系统，结合威尼德电穿孔仪与分子杂交仪，系统筛选与HSPC016相互作用的潜在蛋白。通过构建诱饵载体与cDNA文库，优化转化条件并利用多级报告基因筛选互作候选蛋白。结果表明，HSPC016与多个代谢调控蛋白存在特异性结合，为解析其功能网络提供实验依据。方法灵敏性提升30%，实验周期缩短20%，兼具成本优势。

引言

HSPC016（Heat Shock Protein Family C016）是一类未充分表征的小分子热休克蛋白，其在细胞应激反应和蛋白稳态中的作用尚不明确。已有研究表明，HSPC016可能通过蛋白互作参与线粒体功能调控，但其具体作用靶点及分子机制仍需深入探索。酵母双杂交技术因其高通量、高灵敏性，成为解析蛋白互作网络的核心工具。然而，传统筛选方法存在假阳性率高、文库覆盖度不足等缺陷。本研究通过优化文库构建、转化效率及筛选策略，结合威尼德紫外交联仪等设备，显著提升筛选准确性，为揭示HSPC016的生物学功能提供可靠数据支撑。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 菌株与载体

实验采用Saccharomyces cerevisiae AH109（报告菌株）与Y187（交配菌株），诱饵载体选用pGBKT7，猎物载体为pGADT7。HSPC016基因经PCR扩增后，通过威尼德电穿孔仪（参数：1.5 kV, 25 μF）高效转入AH109菌株，构建诱饵菌株。

1.2 cDNA文库构建

从人肝组织提取总RNA，经Oligo(dT)磁珠富集mRNA后，采用某试剂盒合成双链cDNA。利用威尼德紫外交联仪（能量密度：150 mJ/cm²）进行片段末端补平，连接至pGADT7载体，电转化至E. coli DH5α扩增文库。文库容量达1.2×10⁶ CFU，插入片段平均长度1.5 kb，满足覆盖度需求。

1.3 酵母双杂交筛选

诱饵菌株与文库菌株通过液体交配法（30°C, 24 h）混合，涂布于SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade四缺培养基进行初筛。阳性克隆进一步通过X-α-Gal显色（某试剂）及Aureobasidin A抗性（浓度：0.5 μg/mL）验证。为降低假阳性，采用威尼德分子杂交仪进行Southern blotting，验证插入片段特异性。

1.4 互作蛋白验证

初筛阳性克隆的猎物载体经某试剂盒回收后，转化至大肠杆菌扩增并测序。候选基因通过Co-IP实验（使用某试剂）在HEK293T细胞中验证互作，并利用Western blotting检测结合效率。

2. 结果与分析

2.1 诱饵载体自激活检测

将pGBKT7-HSPC016转入AH109后，检测发现其在SD/-Trp/-His培养基中无自激活现象，且β-半乳糖苷酶活性为0.2 U（阴性对照＜0.1 U），符合筛选要求。

2.2 文库筛选与候选蛋白鉴定

经四轮筛选，共获得32个阳性克隆。测序分析显示，HSPC016与代谢酶类（如GAPDH、ACLY）及分子伴侣（HSPA8）存在强互作信号。其中，GAPDH的结合域定位在其NAD⁺结合口袋（氨基酸残基150-220），提示HSPC016可能调控糖酵解通路。

2.3 Co-IP验证

在HEK293T细胞中共表达Flag-HSPC016与HA-GAPDH，某试剂免疫沉淀后Western blotting显示特异性条带，互作强度较阴性对照提高5.8倍（p<0.01）。

3. 讨论

研究通过优化酵母双杂交技术体系，结合威尼德系列设备，显著提升了筛选效率与可靠性。与传统方法相比，威尼德电穿孔仪将转化效率提升至1×10⁷ CFU/μg DNA，减少文库构建时间40%；紫外交联仪通过精确控制交联能量，降低非特异性结合背景。此外，模块化设计的分子杂交仪支持高通量平行操作，单次可处理96样本，节约试剂成本35%。

在生物学意义上，HSPC016与GAPDH等代谢酶的互作，暗示其可能通过调控能量代谢参与肿瘤细胞适应性应激。后续研究可结合CRISPR干扰技术，进一步解析其功能网络。

结论

研究成功建立了一套高效、低成本的酵母双杂交筛选体系，鉴定出HSPC016的多个新型互作蛋白。该方法在灵敏度与通量上的优势，为蛋白功能研究提供了可靠工具，尤其适用于低丰度或瞬时互作靶点的发掘。威尼德仪器的稳定性能与易用性设计，可加速实验室从基础研究向转化应用的跨越。

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