牙龈卟啉单胞菌 PG0839 突变株构建

引言

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是一种重要的牙周病致病菌，在牙周病的发病过程中起着关键作用。其通过多种毒力因子破坏牙周组织，引发炎症反应，最终导致牙周病的进展。PG0839基因作为牙龈卟啉单胞菌中的一个重要基因，其功能与细菌的致病性密切相关。然而，目前对PG0839基因的具体作用机制尚不清楚。因此，构建PG0839基因突变株，研究该基因的功能，对于深入理解牙龈卟啉单胞菌的致病机制及开发新型牙周病治疗策略具有重要意义。

本研究旨在通过基因工程技术，构建牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株，并探索其转化体系，为后续的功能研究奠定基础。通过PCR扩增、克隆、载体构建及电穿孔转化等一系列实验步骤，成功获得PG0839基因突变菌株，为后续的功能验证及致病机制研究提供了重要工具。

材料与方法

1. 实验材料

本研究采用的主要菌株包括牙龈卟啉单胞菌W83（P.gingivalis W83）、大肠杆菌JM109（Escherichia coli JM109）以及含有红霉素抗性基因的质粒pVA2198。实验所需试剂包括某品牌DNA聚合酶、某品牌限制性内切酶、某品牌T4 DNA连接酶、某品牌质粒提取试剂盒、某品牌凝胶回收试剂盒以及威尼德电穿孔仪等。培养基采用BHI培养基和LB培养基，分别用于牙龈卟啉单胞菌和大肠杆菌的培养。

2. 实验方法

2.1 细菌培养

P.gingivalis W83菌株接种于新鲜配制的含有5%无菌脱纤维羊血、氯化血红素（5μg/mL）和维生素K（0.5μg/mL）的BHI培养基中，37℃厌氧培养5-7天（10%H2、10%CO2、80%N2）。E.coli JM109菌株接种于LB培养基中，37℃需氧培养。

2.2 PG0839基因的扩增及克隆

根据PG0839基因序列（GenBank No:AE015924），使用Primer Premier 5.0软件设计引物，并使用BLAST对引物进行同源性分析。PCR反应体系包括模板DNA、引物、dNTPs、某品牌DNA聚合酶及缓冲液。反应条件为预变性94℃ 2分钟，变性98℃ 10秒，退火55℃ 15秒，延伸72℃ 90秒，共30个循环，最后延伸72℃ 7分钟。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用某品牌凝胶回收试剂盒回收目的片段。

将回收后的PCR产物与pUC19载体分别经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，然后使用某品牌T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物和载体连接。连接产物热转化至E.coli JM109感受态细胞中，筛选阳性克隆后增菌，提取质粒并测序。将测序结果与GenBank中序列进行同源性比对分析，确认基因编码区与参考序列一致后，将该质粒命名为pPG0839-1。

2.3 质粒pPG0839-2的构建

以质粒pVA2198为模板，使用特异性引物进行PCR扩增红霉素抗性基因（erm）。PCR反应条件同上。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后回收。将回收后的PCR产物与pMD19-T simple载体连接，转化至E.coli JM109感受态细胞中，筛选阳性克隆后增菌，提取质粒并命名为pErm。

质粒pErm经StuⅠ酶切后，回收2101bp的erm基因片段。同时，使用EcoRⅤ酶切pPG0839-1质粒，得到线性片段。将线性片段使用去磷酸化试剂盒处理后，与erm基因片段使用某品牌DNA连接试剂盒进行平末端连接。连接产物转化至E.coli JM109感受态细胞中，筛选反向阳性克隆并测序确认。将测序正确的质粒命名为pPG0839-2。

2.4 电穿孔转化

将处于对数生长期的P.gingivalis W83菌液接种于新鲜配制的BHI液体培养基中，37℃厌氧培养过夜。取过夜培养的菌液加入新鲜BHI液体培养基中，继续孵育4小时。然后收集细菌细胞，使用电穿孔缓冲液洗涤后重悬。将细胞悬液与DNA共同加入无菌电极杯中，使用威尼德电穿孔仪进行电穿孔转化。电穿孔条件为2440V、5ms。电穿孔后，冰浴5分钟。

2.5 突变株的筛选与检测

将电穿孔后的细胞悬液接种于BHI液体培养基中，37℃厌氧培养16小时。然后取菌液接种于含5μg红霉素的抗性BHI培养基中，作为实验组。同时，在抗性和非抗性BHI培养基上接种P.gingivalis W83菌株作为对照组。37℃厌氧培养7天后，收集实验组中的阳性克隆菌体，即为PG0839基因突变菌株。使用PCR及测序方法对突变株进行进一步确认。

结果

经过上述实验步骤，成功构建了牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株。PCR及测序结果显示，erm基因已成功插入到PG0839基因中，且插入位点正确。在抗性BHI培养基上筛选得到的阳性克隆菌体，经PCR及测序验证后确认为PG0839基因突变菌株。

讨论

3.1 牙龈卟啉单胞菌PG0839基因的功能研究

本研究成功构建了牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株，为后续的功能研究提供了重要工具。通过基因工程技术，将红霉素抗性基因插入到PG0839基因中，实现了对该基因的定点突变。这种方法不仅操作简便、效率高，而且能够准确控制突变位点，为后续的功能验证及致病机制研究提供了有力支持。

3.2 构建转化体系的意义

构建牙龈卟啉单胞菌的转化体系是实现基因工程操作的基础。本研究通过优化电穿孔转化条件，成功将外源DNA导入牙龈卟啉单胞菌中，实现了基因的定点突变。这一转化体系的建立，不仅为PG0839基因突变株的构建提供了技术支持，也为其他基因的功能研究及基因工程操作提供了可借鉴的经验。

3.3 研究的创新与应用前景

本研究的创新之处在于成功构建了牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株，并探索了适用于该菌的基因工程操作技术。这一成果不仅丰富了牙周病致病菌的基因工程研究内容，也为深入理解牙龈卟啉单胞菌的致病机制及开发新型治疗策略提供了重要工具。

在应用前景方面，PG0839基因突变株的构建为牙周病的治疗研究提供了新的思路。通过深入研究PG0839基因的功能及其在牙周病发病过程中的作用机制，有望开发出针对该基因的新型治疗策略，从而提高牙周病的治疗效果。此外，该突变株还可作为牙周病疫苗研发的候选菌株，为牙周病的预防和治疗提供新的途径。

结论

本研究成功构建了牙龈卟啉单胞菌PG0839基因突变株，并探索了适用于该菌的基因工程操作技术。通过PCR扩增、克隆、载体构建及电穿孔转化等一系列实验步骤，实现了对PG0839基因的定点突变。该突变株的构建为后续的功能研究及致病机制研究提供了重要工具，也为牙周病的治疗研究提供了新的思路。本研究不仅丰富了牙周病致病菌的基因工程研究内容，也为深入理解牙龈卟啉单胞菌的致病机制及开发新型治疗策略奠定了坚实基础。未来，我们将继续深入研究PG0839基因的功能及其在牙周病发病过程中的作用机制，为牙周病的预防和治疗贡献更多力量。