可靠    创新    同行    发展

基于微滴的微流体已经渗透到生命科学的许多领域，包括生物化学、生物学和医学。油包水液滴作为独立的飞升到纳升的储层，以最小的样品输入实现（生物）化学反应的并行化。在液滴微流控的应用范围中，利用泊松分离隔间中的单分子进行生物分子的数字检测，由于这些方法的高精度、灵敏度和鲁棒性而受到了相当大的关注。然而，虽然液滴通量可以非常高，但与基于孔板的分析相比，这些方法的样品通量较差。这种限制来自于必须将每个样品独立地转化为单分散乳液。在本文中，我们报告了一种通用装置，该装置使用单个微流控芯片对多达15个样品进行快速顺序划分。3D打印的样品转子装载了所有样品并连接到压力源。然后使用简单的磁驱动将样品注入微流控芯片中，而不会造成压力中断。这个过程产生单分散液滴具有高样品到样品的一致性。我们还描述了一种荧光条形码策略，允许所有样品同时收集，孵育，成像和分析，从而显着减少化验的时间。作为一个应用实例，我们在不到2小时的时间内对8个样本的DNA扩增子进行了液滴数字PCR定量分析。我们进一步验证了我们的方法，证明了使用等温核酸扩增化学方法对来自人类样本的11个microRNA进行平行定量。作为一个片外装置，样品转换器可以连接到各种微流体几何形状，因此，用于广泛的应用。

在过去的十年中，液滴微流控得到了相当大的关注。使用单分散的油包水液滴（w/o）乳液作为独立反应器，开辟了小型化、并行化的道路，节省了反应物成本和样品体积要求。基于乳化剂的检测方法已经广泛应用于生物、化学等许多领域。微流控液滴发生器现在用于进行化学反应、实验条件的高通量筛选、通过定向进化进行蛋白质工程、单细胞分析、酶分析、数字量化方法和胶体制造等。这些应用需要具有小尺寸分散的水滴，通常通过在控制流动条件下在单个油/水交界处（喷嘴）形成水滴来获得。许多微流体设计已经被描述为产生从飞升到微升不等的液滴体积。此外，还介绍了增加液滴生成速率的方法，例如使用多层通道和平行微流控结。

然而，这些技术逐个处理独立的样品，每个新样品需要一个微流控芯片。为了在单个芯片中处理多个样品，可以将基于注射回路或移液机器人的商用自动进样器系统耦合到芯片上。这些系统相对昂贵。此外，单分散乳剂的要求在样品切换过程中也施加了对流动的精确控制，这可能并不总是得到保证。其他定制方法也有报道，但它们通常针对生产更大（纳升）液滴的组合成分混合物。例如，Zec等人设计了一种定制装置，该装置由毛细管与手动XY级和电动z轴相结合制成，用于将多个样品段塞引入芯片中，在那里它们被分割成大液滴，并进一步注入额外的化合物。为了解决样品吞吐量问题，Lim等人最近提出了一种微流控芯片，该芯片使用加压腔并行地对十个样品进行分区。然而，该系统不能直接适用于不同的微流控设备，因为它需要重新设计芯片并为每个特定的新应用进行光刻。此外，每个样品在不同的微流体喷嘴中乳化，因此需要优化微加工程序以避免样品之间的差异。

总而言之，在对数字生物分析兴趣浓厚的背景下，缺乏廉价和通用的方法来持续乳化大量独立样品，同时最大限度地减少芯片消耗。在本文中，我们提出了一种低成本，片外样品转换器，可直接适用于任何现有的微流体乳化装置，而无需修改。基于3D打印样品托盘，样品转换器允许使用单个芯片串行乳化多达15个样品，显着改善了时间和试剂使用。这是通过使用最近报道的无泄漏等温扩增化学同时对细胞提取物中的多个microRNA进行数字量化来验证的。我们讨论了潜在的携带污染问题，并表明它们可以通过在每个样品之间引入水塞来有效地减轻。我们进一步展示了芯片外装置的可能应用，通过在不到2小时的时间内用液滴数字PCR对来自8个样品的DNA目标进行定量。

微流控芯片

面具是用AutoCAD设计的，并在透明胶片上进行照相描摹。使用标准的多层软光刻技术制造模具。简单地说，微流控通道在4英寸硅片上绘有图案，硅片上涂有5ml SU-8光刻胶（MicroChem Corp.， MA， USA），烘烤，暴露在紫外线下并显像。用异丙醇清洗并干燥后，用一层5毫米厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS, Dow Corning, Sylgard 184）与固化剂以10:1 w/w的比例混合，覆盖模具，在70°C下烘烤2小时。在PDMS板起球后，用直径1.5 mm的活检打孔机钻进、出口。PDMS芯片被键合在1毫米厚的玻璃载玻片（Paul Marienfeld, GmbH & Co. k.g., Germany）上，在氧等离子体暴露后立即用丙酮和异丙醇进行顺序清洗。最后，芯片在200°C下烘烤5小时，使通道疏水。

液滴微球产生

为了实时监测微流控芯片的液滴微球生成，将微流控芯片放置在明场显微镜上。样品转换器和连续相连接到液滴芯片的入口。连续相由含1%或4% （w/w）氟表面活性剂（Fluosurf, Emulseo, France）的氟化油（Novec-7500, 3M）组成，分别用于等温扩增和PCR扩增。样品加入浓度在0到200 nM之间的葡聚糖结合染料，包括葡聚糖Texas Red 70000 MW，葡聚糖Alexa Fluor 488 3000 MW，葡聚糖Alexa Fluor 647 10000 MW，葡聚糖Cascade Blue 10000 MW赖氨酸固定物（ThermoFisher Scientific）。液滴微球是通过压力泵驱动样品溶液流动，通过流体动力聚焦产生。通过使用外部磁铁来操纵样品架，通过切换管的位置来连续乳化样品。在每个样品之间插入一个气泡和可选的水段塞（0.5μL-1.5 cm的聚四氟乙烯管）。使用200μL吸管头在出口处收集液滴。

液滴微球成像观察

用透射电镜和荧光显微镜对液滴进行分析。70 × 50 × 1 mm的玻璃载玻片通过疏水试剂制成疏水性玻片。比液滴微球稍大的聚苯乙烯珠，用作硬球间隔，被标记在玻片上，并在100°C下蒸发。将液滴乳液沉积在玻片上，并用疏水试剂处理过的22 × 22 mm盖片（VWR）覆盖。在图4、5和6中，每个种群分别分析了至少5000、5000和10000个液滴微球。轻轻按压盖盖以获得紧密排列的液滴的单层阵列。腔室用环氧胶（Sader）密封，使用配备电动XY工作台（Nikon）、相机Nikon DS-Qi2和CoolLed pE-4000照明光源的Nikon Eclipse Ti荧光显微镜获取图像。根据液滴大小，采用复消色差10× （N.A. 0.45, WD 4.0）或20× （N.A. 0.75, WD 1.0）物镜。假彩色图像是用开源ImageJ软件生成的。

数据分析

使用Mathematica软件（Wolfram）提取定量数据。简单地说，利用亮场图像分割液滴。液滴的直径是假设为球形的（当聚苯乙烯珠子比液滴大时，液滴被用作底部和顶部滑动之间的间隔）。根据组件的大小（以消除在生成过程中由于聚结或不稳定而产生的较大液滴）和圆度（以消除非圆形组件）对组件进行过滤。提取质心后，对每个通道中每个液滴的荧光进行平均。对红色和橙色通道之间的光串扰进行补偿，并根据条形码的强度对液滴种群进行排序。然后计算每个样品的输出测量（microRNA浓度，DNA片段浓度，95%置信区间），如其他地方所述。

等温扩增技术检测microRNA

从Biomers （Germany）获得hplc纯化的寡核苷酸，保存在- 20°C。人结肠总RNA提取物购自Thermofisher Scientific公司，报价为1mg/mL，保存于- 80°C。序列是根据先前报道的规则设计的。所有反应混合物在200μL PCR管中于4°C下组装。将四种模板（自催化模板、伪模板、转化模板、报告模板，终浓度分别为50、12、0.5、40 nM）与反应缓冲液(20 mM Tris HCl pH 7.9、10mM （NH4)2SO4、40mMKCl、10mMMg2SO4、50μ meachdntp、0.1% (w/v) Synperonic F 104、2μM netropsin，均购自Sigma Aldrich）混合。酶混合物（BSA 200 μg/mL, NbBsmI 200 μ/ mL, Vent（外链）DNA聚合酶80 μ/ mL， Nt·BstNBI 80 μ/ mL, BsmI 70 μ/ mL）（全部来自New England Biolabs）自纯化的ttRecJ外链核酸酶 23 nM)。形成微滴后，在qPCR热循环器（CFX96 Touch, Bio-Rad）中于50°C孵育3小时。最后按上述方法对液滴进行分析。

液滴数字PCR

所有PCR反应混合物在200μL PCR管中于4°C下组装。PCR反应包括1× Thermopol缓冲液（New EnglandBiolabs, 20mMTris-HCl pH8.8, 10mM(NH4)2SO4, 10 mMKCl, 2 mMMgSO4, 0.1% Triton X-100），各添加200μM dNTP， 200 nM正向（ccatgctaaggaattacg）和反向（atttttttttgcaatgaagcg）引物，0.5× Evagreen (Biotium, Inc.， CA， USA), 0.4% w/v Pluronic F127 (Merk)， 200μg mL -1 BSA和40 u / mLVent（外外）DNA聚合酶。以含有Nt·bstNBI基因的5.5 kb质粒psB3K3为模板，质粒c端与gfp基因融合。在CFX一触仪（Biorad）上进行qPCR或ddPCR扩增：样品先在95°C加热5分钟，然后进行20个循环（ddPCR）或40个循环（qPCR）， 95°C加热30秒，53°C加热30秒，72°C加热20秒。可选地，在运行结束时通过将样品从20°C加热到95°C并测量每0.5°C的荧光来记录熔化曲线。PCR产物采用0.8% w/v琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析（图7S）。如上所述，使用20倍放大镜进行液滴成像。有趣的是，我们注意到绿素在阳性液滴中比在无目标液滴中光漂白得更快，这导致信噪比增加（图8S）。因此，在图像采集之前，每帧在100%照明功率下曝光20秒。

图1：微流体装置。a.换样器由一个封闭在透明容器中的3D打印圆形样品托盘组成。该容器被加压，允许将样品注入微流控芯片并形成油包水液滴。使用磁铁将注射管从一根管子切换到另一根管子，将样品依次注入芯片中。通过对不同荧光分子浓度的样品进行条形码（条形码），可以将所有液滴收集在一起，同时进行孵育和分析。b.样品托盘（左）与容器（右）的注释图片。

图2：15个样品在20μm油包水滴中连续乳化。样品对应于不同条形码组合的水溶液（Alexa488， Alexa647或cascade - blue共轭右旋糖酐在0,100或200nM）。a.每个样品的条形码浓度。b.液滴阵列的显微镜快照。c. 15个条形码液滴种群的3D图。

图3：适用于各种微流控装置的片外换样器。a.测试了三个流动聚焦连接：使用20μm宽的喷嘴（顶部）乳化7个样品（标记为TexasRed， Alexa488和cascadeblue共轭右旋糖trans），使用10μm宽的喷嘴（中间）乳化12个样品，使用7μm宽的喷嘴乳化4个样品，共流几何形状。对于后一种装置，样品转换器连接到左侧进口（绿色荧光），而右侧进口连接到缓冲溶液。b.成像室快照。c.条形码液滴种群的3D图。d.每个液滴种群的大小分布（每个种群计数约500个液滴，参见液滴大小估计的材料和方法）。括号内的数字是变异系数。上面的红色数字表示所有液滴种群的大小分散。比例尺= 100μm。

图4：从人总RNA提取物中平行检测microRNA。a.研究中使用的等温扩增策略，基于先前报道的无背景分子放大器。它依赖于在自催化模板（aT）上使用聚合/缺口机制的12碱基DNA触发器的信号放大。伪模板（pT）被添加到系统中，以吸收自催化模板上的虚假反应产生的泄漏，避免背景放大。靶特异性由一个转换模板（cT）保证，该模板在microRNA靶杂交后产生触发序列。扩增用双标记报告模板（rT，用Atto633荧光团和BHQ2猝灭剂标记）显示，当与触发序列结合时发出荧光。b.扩增后12个液滴群体（CascadeBlue, TexasRed， alexa488标记的dextrans）的显微镜图像。c.每个液滴群体的归一化荧光。d.测量浓度，由泊松统计量计算。误差条基于95%置信区间。

图5：样品间的残留污染。阴性对照（NC，无靶）和阳性对照（PC, 1 pM Let7a）交替使用样品交换器乳化。该图报告了每个样品的阳性液滴百分比和相应的浓度。

图6：插入质粒psB3K3的Nt·bstNBI基因163碱基扩增子的微滴数字PCR结果。将目标序列经过一系列稀释后的条形码样品（CascadeBlue, TexasRed, Alexa647）分布在油包水液滴中，并通过PCR扩增目标。a.部分成像室的显微镜快照：使用条形码荧光（左，合成图像）对液滴种群进行分割，使用双链特异性染料EvaGreen（右）对扩增进行可视化。b.每个飞沫群体检测到阳性事件。c.根据泊松定律计算的测量浓度作为稀释系数的函数绘制。误差条对应于95%置信区间。数据点用线性回归拟合。

我们序列化方法的另一个潜在应用是使用标准样品的数字分析的校准和验证。为了证明这一点，我们使用了不同的化学方法，对含有Nt·bstNBI基因和gfp基因融合的模板质粒psB3K3的163个分子量的扩增子进行了滴数PCR （ddPCR）。用连续稀释的DNA模板加入PCR混合物，连续乳化，液滴进行热循环，并通过荧光显微镜进行分析。ddPCR结果见图6。根据实验设计，我们观察到模板浓度与稀释系数之间呈线性相关（R2 =0.99）。检测时间低于2小时（样品制备20分钟，液滴生成30分钟，PCR扩增30分钟，数据分析30分钟），这使得无需特定的数字PCR仪器即可常规进行多次ddPCR。例如，这种方法适用于精确的DNA定量（质粒或其他表达载体，基因组DNA， qPCR标准或NGS文库），通常使用吸光度或荧光测量进行，这可能容易产生不准确性。

图6S：液滴微球分析。我们在这里描述的实验对应于通过数字等温扩增来定量合成的microRNA Let7a。从样品1到样品6，Let7a的期望浓度分别为0、2.7、11、44、175和700 fM。a.通过透射显微镜（亮场）和荧光显微镜（这里包括条形码TexasRed、Alexa647和Cascade Blue的3个通道以及数字读出器FAM的荧光输出对应的通道）对单层液滴进行成像。b.使用亮场图像分割单个液滴。c.根据液滴的大小（以像素为单位半径）和圆度（> 0.9）选择液滴。蓝色框中包含所有符合尺寸和圆度参数的液滴。一个额外的密度过滤器，排除了在这个盒子中被隔离的少数液滴，用红色表示的对象被保留下来用于下游分析。d.液滴荧光条形码三维图：对于每一个选定的液滴，每个通道的荧光在一个与物体质心和半径r （r略小于液滴半径）对应的中心圆盘上平均。液滴的数量根据它们在条形码通道中的荧光进行分类。e.分选后条形码和探针荧光的荧光图。f.目标分子（这里是Let7a）的浓度是用泊松定律计算的，假设目标分子在液滴上的随机分布

图7S：实时PCR。163个碱基长扩增子的实时PCR从不同的模板稀释倍数开始，从10^1到10^5稀释系数。a.用Evgreen荧光信号记录实时监测溶液中qPCR扩增。b.相应的熔体曲线。c.从实时曲线分析中提取周期量化（Cq）值。d. Cq值绘制为所用稀释系数的函数。我们观察到与图6相似的线性相关（R2= 0.998）。e.在0.8% w/v琼脂糖凝胶中扩增子迁移。

图8S：数字PCR后滴光漂白后的反向对比。a.曝光时间t = 1 s（左）和t = 20 s（右）后的二维液滴阵列显微镜图像。采集时间为1s。PCR扩增后，我们发现阴性滴比阳性滴更能抵抗光漂白。因此，阳性液滴比阴性液滴的荧光性更弱，这与经典的液滴数字PCR读数相反。b.小点的荧光发射随曝光时间的变化（红色时间迹=负液滴，绿色时间迹=正液滴）。c.信噪比（SNR）作为曝光时间的函数（t = 1 s时信噪比为1.37,t = 20 s时信噪比为1.47）。

我们展示了一种低成本的样品交换装置，该装置由3D打印的磁性支架插入加压舱中制成。这种片外装置可以适应任何微流控装置，以提高样品吞吐量。在大多数基于液滴的方案中，只有一小部分液滴被分析（数万到数十万），但更多的液滴被生成以方便对乳剂的操作。在我们的方法中，来自许多样品的乳剂被收集在同一个小瓶中，同时处理和分析，大大减少了所需的时间。由于内部压力不受干扰，所有样品都以均匀一致的方式乳化。例如，从15个样品中分别定量一个目标microRNA将需要每个样品乳化10μL。考虑到生成速率为10 kHz，液滴体积为0.5 pL，每个样品需要30分钟，因此生成时间超过7小时。使用我们的样品转换器，将每个样品的少于1 μL注入芯片，并将乳剂收集在一起，最终体积为~ 15 μL，足以易于操作，同时将生成时间缩短至不到1小时。使用非常灵敏的数字分析，我们还表明，每个样品之间引入的水段塞足以清洗可能的污染物，并避免样品到样品的污染。样品交换器易于制造和用户友好，具有两个主要优点：(i)成本（15个样品设备约3欧元，包括打印灯丝，两个磁铁和容器，参见材料和方法部分），比市售平台低几个数量级；（ii）通用性，因为它可以连接到广泛的现有微流体装置，因此具有广泛的适用性。然而，一些改进仍然可以提高它的能力。例如，我们在这里使用了一个样品架，15个位置装在一个直径52毫米的容器中。使用更大的容器，应该可以按比例增加样品的数量。我们的方法的另一个限制是，从一个样品切换到另一个是一个手动过程，涉及到用户使用磁铁操纵样品转换器。未来的发展将致力于使用可编程的电动转子作为多功能自动进样器来实现样品更换器的自动化。

参考文献：

Menezes R, Dramé-Maigné A, Taly V, Rondelez Y, Gines G. Streamlined digital bioassays with a 3D printed sample changer. Analyst. 2020 Jan 21;145(2):572-581. doi: 10.1039/c9an01744e. 

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