你真的了解内毒素吗？从结构特征到理化特性，360度解读这个让FDA头疼、生物制药梦魇的“顽固分子”

一、什么是内毒素？

内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌外膜中独特的结构成分，主要为脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）。因此，内毒素与脂多糖常同义使用。内毒素广泛存在于大肠杆菌、沙门氏菌、布氏杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌等革兰氏阴性菌的细胞壁中，一些真菌、立克次氏体、支原体等微生物中也可能存在。内毒素存在于自然界的各个角落，如水、土壤、空气以及人和动物体内。

内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜特有组分（源自文献：DOI: 10.1111/prd.12433）

内毒素位于革兰氏阴性菌细胞壁的最外层。细胞壁主要功能是维持细胞形态和结构完整性，并影响细菌与宿主免疫系统的相互作用。革兰氏阴性菌具有双层细胞膜，其外膜并非磷脂双层，而是不对称结构，内叶含有磷脂，外叶含有脂多糖（LPS）。LPS占外膜总分子的10-15%，但占外膜总表面积的75%。因此，脂多糖最基本的作用是将外膜转变为革兰氏阴性菌有效屏障，对抗菌化合物产生天然抵抗力。

细菌在正常生长和繁殖过程中仅释放少量内毒素，大部分用于维持结构稳定。但是在菌体裂解、自溶或死亡后会大量释放内毒素，展现出强大的毒性。来自不同细菌的内毒素毒性大致相同，可引起发热、微循环障碍、内毒素休克、血管内凝血等不良反应。

内毒素具有免疫激活特性，通过刺激宿主细胞产生大量具有致热效应的炎症细胞因子来诱导免疫反应，从而可能引发炎症反应。因此，在动物免疫实验、细胞培养过程中，微量内毒素残留都可能影响实验结果。为保证生物制品、注射剂用品安全，各国药品食品监管部门制定的药典中，都会对内毒素制定严格的检测方法和含量标准。

二、内毒素有哪些结构特征？

内毒素的主要成分是脂多糖（LPS），基本结构高度保守。脂肪酸链组成的疏水结构将脂多糖分子锚定在细胞膜中，亲水部分从膜中突出。LPS结构包括三部分：从内到外依次为脂质A（Lipid A）、核心多糖（Oligosaccharide core）和O-抗原（O-antigen，也称之为O-特异性侧链）。

革兰氏阴性菌的内毒素组分（源自文献：doi: 10.3390/toxins13080533）

根据LPS是否含有O-抗原，将其分为光滑型LPS（Smooth LPS, S-LPS）和粗糙型LPS（Rough LPS, R-LPS，也称为脂寡糖）。光滑型LPS为完整结构，存在于肠杆菌科、假单胞菌、钩端螺旋体和弧菌中。脑膜炎奈瑟菌、百日咳鲍特菌、不动杆菌、脆弱拟杆菌等细菌中存在粗糙型LPS。

LPS的结构（源自文献：DOI: 10.1111/prd.12433）

1，脂质A（Lipid A）：毒性核心

脂质A是细菌内毒素的主要成分，嵌在细菌外膜的磷脂层中。脂质A在不同革兰氏阴性菌中结构存在一定差异，但在同一菌株中结构基本相同。脂质A是一种磷脂酰葡萄糖胺，其骨架结构为D-葡萄糖胺（GlcN）二糖，含有磷酸基团，并与4-8个3-羟基脂肪酸链相连。

脂质A是人类先天免疫系统识别的主要脂多糖表位，与细菌的内毒素活性密切相关，是LPS的生物活性中心。脂质A没有种属特异性，结构相似，因此其毒性反应相似，能够激活机体免疫系统引发炎症反应。

脂质A的内毒素活性取决于其所含脂肪酸数量（4至8个）、酰链长度（10-18个碳原子）和饱和程度，以及其磷酸化状态。脂肪酸长度和数量的变化会导致激动剂活性丧失。磷酸化模式显著影响内毒素活性和对抗菌肽的抵抗力。脂质A通常包含四条直接连接到D-葡萄糖胺二糖的初级酰链，以及数量可变的连接到初级酰链上的次级酰链。LPS完全刺激免疫系统，需要脂质A部分存在六条酰链，五酰或七酰异构体的活性要低100倍，四酰异构体无活性。六酰脂质A也是检测细菌入侵所必需的。

2，核心多糖：连接桥梁

位于脂质A和O抗原之间，起到连接作用，由己糖、庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸等组成，结构相对保守。

3，O-抗原（O-antigen）：血清学分类基础

O-特异性抗原位于细菌细胞壁的最外层，由若干重复的寡糖组成，具有抗原性。不同细菌间O-抗原的组成、化学结构和排列高度特异，同一菌株的不同类型之间也存在差异。因此，O-抗原是革兰氏阴性菌的血清学分类基础。

O-抗原是LPS中最容易发生变异的结构部分。至少有20种不同的糖分子可组成O-抗原。O-抗原对于细菌与特定宿主免疫细胞和感受器之间的相互作用至关重要，在保护免疫监视补体系统中发挥重要作用。O-抗原的修饰和变异在感染中起重要作用，通过影响粘附、定植和逃避宿主防御机制使细菌受益。

三、内毒素“令人头疼”的理化特性？

内毒素之所以成为生物制药行业的噩梦，与其“顽固”的理化特性有关。

1，超-强耐热

细菌内毒素耐高温。常规的湿热灭菌（121℃，15-20分钟）几乎对其无效。研究发现，115℃湿热处理30分钟仅能破坏25%左右。想要完全灭活需要在180℃高温下持续3-4小时或250℃干热处理30分钟以上。一般的化学试剂也不会影响内毒素的活性，只有强酸、强碱或强氧化剂才可以破坏其结构。

2，两亲性难去除

内毒素既有亲水的核心多糖和O-抗原，又有疏水的脂质A。在水溶液中，内毒素聚集形成胶束、囊泡或层状结构，分子量从10kDa的单体变成超过1000kDa的大分子复合物，使其难以通过常规过滤去除。内毒素带负电荷，可吸附于容器表面或与蛋白质结合，增加去除难度。

3，低剂量可致病

仅1ng就可引起热原反应，更高剂量可导致败血症、休克甚至死亡。内毒素单位为EU，一般用EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示。下表中列出了美国FDA关于不同生物医学制品或用品的内毒素水平阈值。

表1. 各种生物医学应用的内毒素水平标准限值

总之，内毒素在自然界无处不在，难以清除。内毒素能够触发先天免疫反应、强烈的炎症反应和抗菌反应，通过与蛋白质结合、导致蛋白聚集，增加生物制品的安全风险。因此，降低生物制品的内毒素势在必行。

义翘神州ProPure™超低内毒素蛋白及定制服务

义翘神州位于德克萨斯州的生物工程中心（C4B）采用先进的技术和设备生产ProPure™超低内毒素蛋白，内毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），显著优于行业标准（USP <85>：0.5 EU/mg），适用于临床前动物研究、严格的细胞实验与高敏检测分析。同时，C4B还提供超低内毒素蛋白定制服务，满足临床前和药物开发中对内毒素控制的更高标准需求。

超低内毒素蛋白产品列表（热门靶点）

参考文献：

Pirkko J. Pussinen, et al. Periodontitis and cardiometabolic disorders: The role of lipopolysaccharide and endotoxemia. Periodontology 2000. DOI: 10.1111/prd.12433

Rosalia Marcano, et al. Pathological and Therapeutic Approach to Endotoxin-Secreting Bacteria Involved in Periodontal Disease. Toxins 2021, https://doi.org/10.3390/toxins13080533