空间代谢组学助力结核药物临床阶段可视化研究

结核病是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的常见传染病，每年影响全球约1000万人，2022年造成130万人死亡。中心坏死性肉芽肿是人类结核病的组织病理学标志，它由富含脂质、非血管化的坏死核心组成，毗邻泡沫状巨噬细胞边缘，并被纤维囊和一层上皮样巨噬细胞包围。在这些坏死病变中，细胞外 Mtb 可以处于代谢休眠阶段，受到免疫系统的良好保护。此外，由于其复杂的结构，抗生素扩散到这些病变中可能会受到阻碍。然而，药物穿透坏死性肉芽肿的能力显著影响治疗效果。因此，抗分枝杆菌候选药物的高效临床前筛选和测试对于新型疗法的快速开发至关重要。

MALDI质谱成像非常适合研究组织样本中化合物的定位，并且能够同时分析组织切片中内源性和外源性化合物的分布。然而，组织中药物化合物的可靠鉴定需要高质量分辨率和高质量精度，同时高空间分辨能力能够确保组织生物学结构的精准划分。因此，本研究采用兼具高空间分辨率、高质量分辨率、高质量精度和高灵敏度等众多优势的AP SMALDI-Orbitrap系统以10μm空间分辨率对来自IL-13^tg小鼠模型的中心坏死性肉芽肿中的BTZ-043进行分析，确定其在病灶中的动态分布情况。

为了明确病变病理学与药物分布的相关性，作者对从结核分枝杆菌Mtb感染的IL-13 ^tg小鼠中（给药后2小时处死）获得的肺组织相邻冷冻切片分别进行H&E染色和高分辨率AP SMALDI-Orbitrap成像。H&E染色显示两个高度分层的肉芽肿，中心为嗜酸性粒细胞坏死（图 1a）。两个肉芽肿都被一个突出的纤维包膜包围（图 1b），在纤维包膜旁边检测到泡沫状巨噬细胞边缘，其伊红染色强度较低，但 CD68 阳性（图 1c），并富含脂滴（图 1d），因此与在人肉芽肿中观察到的泡沫状巨噬细胞非常相似。

MALDI成像显示，在整个组织切片中检测到BTZ-043，其中肉芽肿区域丰度更高（图1e）。与H&E染色结果进行关联分析，发现该药物主要分布于肉芽肿的纤维囊内，与主要由泡沫巨噬细胞组成的细胞区室重合。作者进一步绘制了该药物在肉芽肿区域的渗透曲线，其中肉芽肿边缘（图1e中蓝色和紫色的线）位于纤维囊和泡沫状巨噬细胞区域之间。从药物渗透曲线中可以看出，在两个肉芽肿中，该药物强度在边缘（即巨噬细胞层）急剧增加，随后向肉芽肿的中心下降。

图1 病变病理与BTZ-043渗透相关性 （a H&E染色；b三色染色；c CD68/ZN染色；d 油红O染色；e BTZ-043的离子图像，[M+H]⁺, m/z 432.08355；f 两个肉芽肿的BTZ-043渗透曲线。）

为了更详细的研究药物的时空分布情况，作者通过MALDI成像研究了最后一次给药后不同时间点（0.5h、2h、4h、8h）的小鼠肺切片。H&E染色结果显示坏死中心以深紫色可见，其周围的浅紫色区域代表由泡沫状巨噬细胞组成的细胞区室（图2a-d）。

MALDI成像结果显示，最后一次给药后0.5h和2h的BTZ-043分布与图1所示相似，泡沫巨噬细胞层的强度高于周围组织，坏死中心的强度较低（图2e-f）；4h后，该药物均匀分布在肉芽肿中，并完全穿透坏死中心（图2g）；给药后8h，在细胞隔室和坏死中心仍检测到该药物，而周围组织中的药物强度下降，表明BTZ-043在中心坏死性肉芽肿中的滞留时间更长。

图2 MALDI成像展示IL-13^tg小鼠中心坏死性肉芽肿中BTZ-043的时空分布（BTZ-043在0.5 h (a、e）、2 h (b、f）、4 h (c、g）和8 h (d、h）的H&E染色和MALDI成像分布）（点击查看大图）

成功的结核病治疗取决于药物完全穿透含有大多数分枝杆菌的中心坏死性肉芽肿的能力及其在这些病灶内的抗分枝杆菌活性。本研究团队在确定药物最佳治疗剂量、药代动力学参数、体外通透系数的基础上，选用能够形成类人中心坏死性肉芽肿的先进IL-13^tg小鼠模型，结合高分辨MALDI成像准确评估药物在组织中的分布以及时空变化。

本研究开创性地可视化呈现了临床阶段结核药物在中心坏死性肉芽肿中的有效渗透和积累，并证明了其病变活性，为 BTZ-043 补充现有抗生素的能力提供了重要指示。因此，BTZ-043未来有助于缩短治疗方案，防止结核病复发，并阻止耐药性的发展。AP SMALDI- Orbitrap空间代谢组学技术有望更深入地应用于药物研发、临床前药物筛选和测试、疾病研究等领域。

AP-SMALDI 5AF -Orbitrap 质谱成像系统

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