荧光定量PCR之引物设计原则

荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种技术手段。它通过在PCR体系中添加荧光基团来显示DNA产物的累积情况，从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。并且可以通过数据分析计算出起始模板量，这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。

荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里，所以在实验过程中，我们需要注意诸多细节，谨慎操作。小伙伴们看到这里就要着急了，我怎样才能做好qPCR实验，拿到实验结果，发表高分文章，走上人生巅峰呢？

引物设计的好坏，关乎着扩增效率的高低、产物特异性的与否。所以正确设计出引物是qPCR成功的第一步。

首先，我们知道qPCR是特殊的PCR，所以，qPCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则，见下表。

除此之外，qPCR引物设计需要额外注意几点。

1. 扩增片段长度：

扩增效率随着扩增子长度减小而增大，建议扩增产物最好在80-200bp的范围，若产物小于75bp，扩增子很难与引物二聚体区分开，若产物大于300bp，则会因为酶活降低导致扩增效率降低。如果你的扩增产物因为实验需求一定要在500-600bp的话，做qPCR实验时要选用三步法扩增，不要用快速两步法扩增。

2. 区分isoform：

对于同一个基因名来说，可能会有不同的isoform。isoform指的是，对于同一个基因，它的mRNA有多种不同剪接方式，这个时候表达出来的的蛋白可能会有不同，所以小伙伴们在设计实验的时候，一定要想清楚自己要做的是哪一个isoform。

举个“栗子”：比如说一个基因有四种不同的isoform，如果大家想要检测的是四种不同剪接方式转录本之和，那么设计引物时就要针对这四个isoform的共有序列设计。如果只想检测其中一种isoform，那就要在这个isoform与其他三个isoform的不同序列位置设计引物。

3. 跨内含子设计引物：

跨越内含子设计引物可以区分并且规避基因组DNA污染。设计引物时需要让一端或两端引物跨越内含子，以人基因组来说，平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子，80%的外显子长度小于200bp，少于10%的内含子长度在1100bp以上，不到0.01%的内含子长度小于20bp。（Sakharkar MK et al. Distributions of exons and introns in the human genome[J].In Silico Biol. 2004;4(4):387-93.）例如外显子长度200bp，为了兼顾扩增子长度，我们可以把上游引物设置在外显子1和外显子2的中间，下游引物设置在外显子2的位置（如下图所示）。