神经干细胞酪氨酸羟化酶基因转染与表达研究

摘要

酪氨酸羟化酶（TH）基因的重组质粒，利用威尼德电穿孔仪将其转染至神经干细胞（NSCs），探讨TH基因在NSCs中的表达效率及对多巴胺能分化的影响。实验结果显示，转染后细胞TH蛋白表达显著升高，且分化后多巴胺能神经元标志物阳性率增加。结果表明，TH基因转染可有效促进NSCs向多巴胺能方向分化，为神经退行性疾病的细胞治疗提供实验依据。

引言

神经干细胞（NSCs）因其自我更新和多向分化潜能，成为再生医学领域的研究热点。酪氨酸羟化酶（TH）作为多巴胺合成的限速酶，其表达水平直接影响多巴胺能神经元的功能。帕金森病等神经退行性疾病的病理特征为多巴胺能神经元缺失，因此，通过基因编辑技术提升NSCs中TH的表达，诱导其定向分化为功能性多巴胺能神经元，具有重要临床意义。

目前，基因转染技术在干细胞研究中的应用仍面临效率低、毒性大等问题。本研究采用威尼德电穿孔仪优化转染条件，结合紫外交联仪进行载体构建，旨在建立高效、稳定的TH基因转染体系，并系统评估转染后NSCs的增殖、分化能力及TH蛋白表达水平，为后续体内外治疗研究奠定基础。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 细胞培养
实验选用大鼠胚胎来源的神经干细胞，于无血清培养基（某试剂，含EGF和bFGF）中悬浮培养，维持干性。传代时采用某试剂消化液解离细胞团，接种于威尼德分子杂交仪预处理的培养板中，37℃、5% CO₂条件下扩增。

1.2 TH基因重组质粒构建

1. 载体选择：采用pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒载体。

2. 基因克隆：通过PCR扩增大鼠TH基因编码区（GenBank登录号：NM_012740），设计特异性引物（上游：5’-XXX-3’，下游：5’-XXX-3’），使用某试剂高保真酶进行扩增。

3. 载体连接：将纯化后的TH基因片段与线性化载体anmo尔比3:1混合，利用威尼德紫外交联仪（能量：1200 J/m²）进行连接反应。

4. 转化与验证：将连接产物转化至感受态大肠杆菌，挑取单菌落扩增后，通过某试剂质粒提取试剂盒获取重组质粒，并经测序确认序列正确性。

1.3 电穿孔转染

1. 细胞预处理：收集对数生长期NSCs，调整密度至1×10⁶ cells/mL，重悬于某试剂电穿孔缓冲液。

2. 转染参数：取400 μL细胞悬液与10 μg TH重组质粒混合，加入威尼德电穿孔仪（参数：电压200 V，脉冲宽度10 ms，脉冲次数1次）。转染后细胞立即转移至预温培养基，24小时后更换含某试剂嘌呤霉素的筛选培养基，持续筛选7天。

1.4 TH表达检测

1. Western blot：收集转染后细胞，采用某试剂裂解液提取总蛋白。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后以抗TH单克隆抗体（某试剂，1:1000）及HRP标记二抗孵育，威尼德分子杂交仪成像分析条带灰度值。

2. 免疫荧光：将细胞固定后，依次加入TH一抗及FITC标记二抗，DAPI复染核，威尼德荧光显微镜观察并统计阳性细胞比例。

1.5 多巴胺能分化诱导
将转染成功的NSCs接种于多聚赖氨酸包被的培养板，换用分化培养基（某试剂，含BDNF、GDNF及抗坏血酸），每日观察形态变化。第14天通过免疫荧光检测酪氨酸羟化酶（TH）及微管相关蛋白2（MAP2）共表达情况。

1.6 统计学分析
采用某试剂统计分析软件，数据以均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。

2. 结果

2.1 转染效率优化
通过威尼德电穿孔仪参数优化，转染效率达（65.3±4.2）%，显著高于脂质体法（P<0.01），且细胞存活率>85%。

2.2 TH蛋白表达提升
Western blot显示，转染组TH蛋白表达量为对照组的4.8倍（P<0.001）；免疫荧光证实TH阳性细胞占比达62.7%。

2.3 多巴胺能分化能力增强
诱导分化后，转染组TH⁺/MAP2⁺双阳性细胞比例为（38.5±3.1）%，显著高于未转染组（12.4±2.6）%（P<0.01）。

讨论

研究通过电穿孔法实现了TH基因在NSCs中的高效表达。威尼德电穿孔仪因其可控脉冲参数，在保证细胞活性的同时显著提高转染效率。TH过表达不仅促进NSCs向多巴胺能神经元分化，还可能通过激活下游信号通路（如Wnt/β-catenin）增强细胞存活。此外，某试剂筛选体系的引入有效富集了转染阳性细胞，为后续功能研究提供纯净细胞群。

结论

TH基因转染可显著提升神经干细胞的多巴胺能分化能力，威尼德系列仪器的应用为基因转染技术提供了可靠平台。研究为基于NSCs的神经退行性疾病治疗策略开发提供了理论依据与技术参考。

参考文献

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