止疼药让你越用越痒？脊髓NPY神经元解除“封印GRP通路”的真相

阿片类药物是临床中重度疼痛的一线镇痛药，但鞘内或硬膜外给药时，30%-100% 的患者会出现瘙痒副作用，其机制尚未明确。此前研究提示，脊髓背角的μ-阿片受体（MOR）、神经肽Y阳性（NPY?） 抑制性中间神经元、胃泌素释放肽（GRP）-GRP 受体（GRPR）系统可能参与痒觉调控，但具体神经元亚型及环路连接存在争议。

近期，南方科技大学医学院王子龙助理教授联合南方科技大学第一附属医院麻醉科吴超然教授和深圳市南山区人民医院蒋昌宇研究员在Nature Communications杂志发表题为“Neuropeptide Y neurons mediate opioid induced itch by disinhibiting GRP-GRPR microcircuits in the spinal cord”的研究论文，探究了介导阿片诱导的瘙痒类型和其背后的神经环路机制。

王子龙团队近期的研究发现抑制性神经元上的MOR通过解除对下游神经元的抑制，介导吗啡诱导的瘙痒。为进一步深入该机制研究，作者首先通过RNAscope共定位发现了抑制性中间神经元表达的Oprm1基因显著富集于NPY?中间神经元群体。化学遗传鞘内注射氯氮平CNO激活NPY?中间神经元后完全消除了鞘内吗啡注射引起的瘙痒反应，表明NPY?中间神经元参与调控吗啡诱导的抓挠行为以及后肢痒。

条件性敲除NPY?中间神经元上的Oprm1，完全抑制了不同浓度吗啡所引起的小鼠抓挠行为。条件性敲除NPY?中间神经元Oprm1能够完全抑制鞘内注射内吗啡肽-1（EM-1，MOR选择性内源配体）后WT小鼠表现出的剂量依赖性短期抓挠行为。以上结果表明NPY?中间神经元上的MOR同时介导内源性与外源性MOR激动剂诱发的瘙痒。

图1. 阿片类药物诱导的瘙痒由NPY?中间神经元上的MOR介导

接下来，该研究对脊髓切片进行离体电生理记录，以评估吗啡对NPY?中间神经元活动的影响。用Npy^Cre;Ai9报告基因小鼠特异性标记NPY?中间神经元。记录数据显示，吗啡（10μM）诱导脊髓背角17/34个NPY?中间神经元产生向外电流（平均振幅为16.84 pA），此外，吗啡显著抑制了脊髓背角9/22个NPY?中间神经元诱发动作电位，并且显著增加了NPY?中间神经元中引起动作电位所需的最小电流阈值—rheobase。以上结果表明，吗啡通过激活NPY?中间神经元上表达的MOR降低了NPY?中间神经元的兴奋性，这可能进一步解除对瘙痒回路的抑制，引发瘙痒反应。

图2. 吗啡可抑制脊髓背角中 NPY?抑制性中间神经元的兴奋性

鉴于NPY及NPY1R系统在瘙痒传导中已明确的作用，作者接下来探究了 NPY 是否直接调控鞘内注射吗啡诱发的瘙痒。NPY 剂量依赖地显著减轻了吗啡诱发的瘙痒。不同剂量的NPY1R 特异性激动剂LP-NPY也可抑制这些行为，同时NPY1R 选择性拮抗剂 BIBO3304 可完全阻断 LP-NPY 对吗啡诱发瘙痒的影响。Npy1r 全基因敲除（Npy1r^-/-）小鼠中，NPY 无法减轻吗啡诱发的瘙痒。这些结果表明，NPY?神经元是通过释放NPY，对瘙痒环路产生抑制作用。为了探究 NPY-NPY1R 系统是否参与内源性阿片类物质诱发的瘙痒，作者鞘内注射 NPY 和 LP-NPY，发现它们都能明显抑制EM-1（MOR选择性内源配体）引起的瘙痒，表明NPY通过 NPY1R 直接调控阿片类物质诱发的瘙痒反应。

图3. NPY-NPY1R 参与了鞘内阿片类药物引起的瘙痒反应

接下来，作者开始探究当表达MOR的NPY?中间神经元解除抑制后，下游被激活的痒觉相关神经元类型。c-Fos基因检测显示，鞘内注射吗啡显著激活Grp?与Grpr?神经元，脊髓背角和I-II层中Grp?神经元中c-Fos阳性神经元数量均显著增加，在与NPY联用后，该比例均显著下降。此外，鞘内吗啡注射后脊髓背角中Grpr?神经元中c-Fos阳性率也显著增加。

为确定NPY?中间神经元的直接下游神经元类型，作者向Npy^Cre小鼠脊髓（T13-L1节段）中注射Cre依赖型荧光麦胚凝集素（WGA）的rAAV-CAG-DIO-mWGA-mCherry病毒进行顺行示踪。结果显示WGA-mCherry信号在GRP?中间神经元中共表达，但GRPR?神经元中极少，表明NPY?中间神经元向GRP?中间神经元提供突触输入。为进一步证明NPY?与GRP?中间神经元有直接的突触连接，作者在Npy^Cre小鼠腰端脊髓注射了顺行跨单突触病毒HSV（HSV-mCherry）。RNAscope结果显示Grp?中间神经元中存在mCherry阳性信号。

作者又在Grp^Cre小鼠中注射了逆行跨单突触病毒RV-CVS-EnvA-ΔG-tdTomato至脊髓背角，进行逆行示踪。通过RNAscope实验，证实了NPY?与GRP?中间神经元存在突触连接。综上，GRP?中间神经元是NPY?中间神经元的直接下游靶细胞，二者存在单突触连接。

接下来，作者通过RNAscope检测发现，脊髓背角II层中Npy1r与Grp mRNA表达存在高度共定位。为探究GRP?中间神经元在吗啡诱导瘙痒中的作用，作者在Grp^Cre;iDTR小鼠中通过腹腔注射白喉毒素（DTX）特异性消融GRP?神经元。行为学检测显示，吗啡诱导的瘙痒在这些小鼠中显著减弱。进一步，作者在Grp^Cre;hM4Di小鼠中利用化学遗传学抑制GRP?中间神经元，同样显著抑制了吗啡诱导的瘙痒。这些结果表明，GRP?中间神经元是吗啡诱导瘙痒所必需的。

随后，为验证GRP本身是否参与该过程，作者构建了兴奋性中间神经元特异性Grp条件敲除小鼠（Vglut2^Cre;Grp^{???? /????}）。结果发现，敲除Grp基因可显著降低吗啡诱导的瘙痒。鉴于GRP阳性中间神经元激活后会释放GRP，通过作用于GRPR受体诱发瘙痒，作者继而通过鞘内注射GRPR拮抗剂PD176252（10 μg）进行验证。结果显示，PD176252能显著抑制吗啡诱导的瘙痒，表明GRPR是GRP?中间神经元在该行为中的下游信号通路。此外，由于既往报道提示脊髓中GRPR阳性神经元受κ阿片受体（KOR）调控，作者还验证了KOR激动剂纳呋拉啡（40 ng）的作用，发现其可显著阻断吗啡诱导的瘙痒。综上，吗啡诱导的瘙痒行为需要GRP?中间神经元及其分泌的GRP共同参与。

图5. GRP?中间神经元和GRP为吗啡诱导的瘙痒所必需

为探究GRP?中间神经元是否接收来自表达MOR的NPY?中间神经元的抑制性输入，作者通过电生理学检测了吗啡对脊髓I-II层GRP?中间神经元自发性抑制性突触后电流（sIPSCs）的影响。记录数据显示，灌流吗啡（10 μM）显著降低了sIPSCs的频率和幅度。预处理NPY1R选择性拮抗剂BIBO3304不能改变吗啡对sIPSCs的抑制作用。在0.5 μM河豚毒素（TTX）存在的情况下，吗啡（10 μM）也显著降低了微小抑制性突触后电流（mIPSCs）的频率和幅度。这些结果表明，吗啡特异性地抑制了GRP?神经元的sIPSCs，这提示GABA/甘氨酸参与了该抑制性环路。

随后，作者通过在体光纤记录技术，在Grp^Cre;GCamp6f小鼠中检测了吗啡诱导瘙痒过程中GRP?中间神经元的活性。结果发现，注射吗啡后GRP?中间神经元被显著激活，且这种激活与搔抓反应相关。此外，MOR拮抗剂纳洛酮（10 nmol）和NPY（10 μg）都阻断了吗啡（0.3 nmol）对GRP?中间神经元的激活。

作者进一步探究了NPY是否能直接影响GRP?中间神经元的兴奋性。在脊髓背角II层GRP?中间神经元中，灌流NPY（10 μM）显著增加了基强度并减少了诱发的动作电位数量。另外，在脊髓背角II层GRP?中间神经元中，灌流NPY（10 μM）诱发了平均幅度为18.785 pA的外向电流，该电流可被NPY1R 选择性拮抗剂BIBO3304（2 μM）阻断。作者还测试了NPY对GRP?中间神经元激活诱导搔抓行为的影响。在Grp^Cre;hM4Dq小鼠中，使用CNO（10 nmol）进行化学遗传学激活GRP?中间神经元引发了强烈的瘙痒，鞘内注射NPY（10 μg）则完全消除了这种瘙痒。这些结果表明，NPY能直接抑制GRP?中间神经元的兴奋性，并抑制由这些神经元介导的瘙痒。

图7. NPY调控GRP?中间神经元，后者介导瘙痒反应

本研究发现，鞘内注射μ-阿片类药物（如吗啡、EM-1）通过激活脊髓NPY?抑制性中间神经元上的MOR诱发瘙痒。MOR激活会抑制NPY?神经元的兴奋性，从而“去抑制”下游的GRP?中间神经元，并依赖NPY-NPY1R系统调控后者活性。最终，GRP?神经元及其释放的GRP是吗啡致痒的必要条件。综合表明：脊髓NPY?神经元上的MOR激活，通过直接“去抑制”GRP-GRPR微环路，介导阿片致痒。

图8. 吗啡诱导瘙痒的潜在脊髓神经环路示意图

研究亮点：