一、研究背景
子痫前期是一种严重的妊娠并发症，其特征包括高血压和蛋白尿，是导致孕产妇和胎儿发病与死亡的主要原因之一。近年研究表明，胎盘产生的可溶性fms样酪氨酸激酶-1（sFlt-1）水平升高在子痫前期的发病机制中起关键作用。sFlt-1是血管内皮生长因子（VEGF）受体的可溶性形式，它通过拮抗VEGF和胎盘生长因子（PlGF）的功能，导致血管内皮功能障碍。正常妊娠晚期，母体循环中的sFlt-1水平较非妊娠期升高约20倍，而子痫前期患者胎盘中sFlt-1的产生显著上调，进而引起母体循环中sFlt-1水平异常升高。虽然胎盘缺氧和缺血已知可刺激sFlt-1产生，但其具体调控机制尚未完全阐明。硫化氢（H?S）是哺乳动物组织中继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第三种气体信号分子。在胎盘组织中，H?S主要由L-半胱氨酸通过两种酶催化生成：胱硫醚-β-合酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）。近期研究发现，3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）也能在某些组织中产生H?S。先前研究表明，CBS和CSE在正常人类胎盘中有表达，而在子痫前期胎盘中表达下调。动物实验显示，抑制CSE/H?S信号通路会导致孕鼠出现类似子痫前期的症状，包括高血压和循环sFlt-1水平升高。本研宄团队的前期工作也证实，H?S供体和前体物质能抑制人胎盘组织释放sFlt-1。然而，内源性H?S是否调控sFlt-1产生、具体由哪种H?S生成酶介导、以及其分子机制如何，仍有待深入探索。此外，3-MST在胎盘中的表达情况此前未见报道。二、研宄方法
本研究综合运用了多种实验技术来探讨H?S对胎盘sFlt-1产生的调控作用。组织样本采集：研宄收集了19例子痫前期患者和23例健康孕妇的足月胎盘组织（均来自剖宫产），所有样本在获取后一小时内处理并冻存于-80°C。免疫组织化学：使用来自不同公司的抗体（Santa Cruz和Abnova等）对胎盘组织切片进行CBS、CSE和3-MST的定位分析，并通过生物素-链霉亲和素-过氧化物酶系统进行显色。胎盘细胞培养：采用改良的Kliman法从胎盘绒毛组织中分离原代滋养层细胞，并进行体外培养。细胞纯度通过细胞角蛋白7免疫染色验证（>95%）。- 实时定量PCR：检测sFlt-1 mRNA和miR-133b等的表达水平，以β-actin或18s-RNA作为内参。
- Western Blot：分析CBS、CSE和3-MST的蛋白表达水平，以GAPDH作为内参。
- RNA干扰：使用特异性siRNA敲低滋养层细胞中的CBS和CSE表达，以验证其功能。
- 荧光素酶报告基因 assay：将sFlt-1的3‘-UTR片段（含miR-133b结合位点）克隆至载体中，验证miR-133b与sFlt-1的靶向关系。
sFlt-1 mRNA稳定性评估：用转录抑制剂DRB处理细胞，观察NaHS或L-半胱氨酸存在下sFlt-1 mRNA的衰变速率。H?S生成速率测量：本研究的一个技术特点是使用了Unisense H?S微电极传感器（Model H?S-MRCh） 联用Unisense PA2000放大器来实时检测胎盘组织匀浆或细胞中的H?S生成动力学。具体方法为：将样本置于温控微呼吸室中，加入底物L-半胱氨酸和辅因子磷酸吡哆醛（PLP）后，通过传感器信号初始最陡斜率计算H?S生成速率。此微电极技术提供了高灵敏度的实时检测手段，为量化内源性H?S生成提供了可靠数据。在某些实验中，还加入了CSE抑制剂PAG或CBS抑制剂AOAA以确定不同酶的贡献。统计学分析：数据以均值±标准误表示，采用方差分析、LSD-t检验或非参数检验进行统计分析，P < 0.05认为有统计学意义。三、研宄结果与结论
1. H?S生成酶在胎盘中的表达与定位
研宄首先确认了CBS和CSE在人类胎盘中的表达，并首次发现3-MST也在胎盘中表达。免疫组化显示，这三种酶主要定位于合体滋养层细胞，此外在血管内皮中也有表达。值得注意的是，子痫前期胎盘中CBS和CSE的蛋白表达水平显著低于正常胎盘，而3-MST的mRNA和蛋白表达在两组间无显著差异。与此一致，使用Unisense微电极系统测量发现，子痫前期胎盘组织的H?S生成速率显著低于正常胎盘。2. H?S对sFlt-1产生的抑制作用
在体外培养的胎盘滋养层细胞中，H?S供体NaHS和H?S前体物质L-半胱氨酸处理能浓度依赖性地抑制sFlt-1的mRNA表达和蛋白分泌。为确定内源性H?S的作用，研宄使用siRNA分别敲低CBS或CSE的表达。结果显示，在CBS或CSE敲低的细胞中，L-半胱氨酸对sFlt-1产生的抑制作用被逆转，表明CBS和CSE产生的内源性H?S是抑制sFlt-1产生的关键因素。3. H?S通过miR-133b调控sFlt-1的分子机制
为进一步探讨H?S抑制sFlt-1的转录后机制，研宄评估了H?S对sFlt-1 mRNA稳定性的影响。结果表明，NaHS和L-半胱氨酸处理缩短了sFlt-1 mRNA的半衰期。生物信息学分析预测miR-133b等可靶向sFlt-1 mRNA。实验证实，NaHS和L-半胱氨酸能浓度依赖性地增强滋养层细胞中miR-133b的表达。功能实验表明，转染miR-133b mimic可降低sFlt-1的mRNA水平和蛋白分泌，而其抑制剂则产生相反效应。荧光素酶报告基因实验进一步证实，miR-133b可直接作用于sFlt-1 mRNA的3‘-UTR区域，突变其结合位点后此作用消失。4. 子痫前期胎盘中miR-133b的表达变化
临床样本分析显示，与正常胎盘相比，子痫前期胎盘中miR-133b的表达显著下调。相关分析表明，胎盘组织中miR-133b的表达水平与CBS和CSE的表达呈正相关。四、总结
本研宄系统阐明了内源性H?S在调控人胎盘sFlt-1产生中的关键作用及其分子机制。主要结论如下：首先，研宄不仅证实了CBS和CSE在胎盘中的表达，还首次报道了3-MST在人类胎盘合体滋养层中的表达，但3-MST在子痫前期中无显著变化。子痫前期胎盘中CBS和CSE表达下调导致H?S生成减少，这与使用Unisense微电极系统直接测得的H?S生成速率下降结果一致。其次，功能实验证明，由CBS和CSE产生的内源性H?S能有效抑制滋养层细胞sFlt-1的产生。机制上，H?S并非通过影响转录起始，而是通过转录后调控——即增强miR-133b的表达，进而促进miR-133b对sFlt-1 mRNA的降解来实现其抑制作用。研宄通过miR mimic/inhibitor和荧光素酶报告基因实验严谨地证实了sFlt-1是miR-133b的直接靶标。最后，临床相关性分析发现，子痫前期胎盘中miR-133b的表达显著下调，且与CBS和CSE水平正相关，这为子痫前期发病机制提供了新的解释：胎盘H?S生成减少 → miR-133b表达下调 → sFlt-1 mRNA稳定性增加 → sFlt-1产生增多 → 母体血管内皮功能障碍 → 子痫前期临床表现。本研宄的创新点在于首次将H?S信号通路、miRNA调控和子痫前期关键因子sFlt-1联系起来，揭示了内源性H?S通过miR-133b介导的转录后机制抑制sFlt-1产生的新通路。这为理解子痫前期的病理生理机制提供了新的视角，也为开发以H?S系统为靶点的治疗策略提供了理论依据。研宄中应用的Unisense H?S微电极技术为准确量化胎盘组织H?S生成动力学提供了可靠的方法学支持。未来的研宄可进一步探讨H?S调控不同miRNAs表达的分子开关，以及其在其他妊娠相关疾病中的作用。丹麦Unisense微电极可穿刺水体、动物组织、生物膜、颗粒污泥、植物根茎叶、液体-固体扩散边界层，研究微区、微生态的研究系统，微电极穿刺系统可穿刺检测动植物组织器官/沉积物/水/土壤/底泥/生物膜/颗粒污泥等不同深度的nM级O2、NO、N2O、H2S、H2、pH、氧化还原电位、温度等指标变化。unisense微电极尖端最细可达几微米，不破坏被测点微环境，无损伤。
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