生物组织红外成像的全新手段——荧光引导光学光热红外显微光谱

红外显微光谱法是非破坏性、结构敏感的检测方法，目前已在基于分子结构的单细胞领域的研究中发挥重大作用，诸如蛋白构象改变、氧化还原、脂质体的产生与降解等。但是受制于红外光谱仪本身的限制，对于生物组织样品来说制样非常困难，因此极大的限制了红外光谱在生物医学方面的应用。

O-PTIR (Optical Photothermal Infrared) 光学光热红外光谱是一种快速简单的非接触式光学技术，通过检测由于本征红外吸收引发的样品表面快速的光热膨胀或收缩，克服了传统IR衍射的极限，空间分辨率可达500 nm。

近期，美国PSC公司又推出了非接触亚微米分辨荧光红外拉曼同步测量系统mIRage-LS，将O-PTIR技术与荧光（FL）进一步有机结合，利用落射荧光快速定位 O-PTIR 测量的区域，提供了对样品荧光标记区域以及邻近未标记组织的化学结构的快速光谱分析。

图 1. FL-OPTIR 显微镜基本原理和观测方法

这项全新的技术对样品要求非常低，而红外光谱的空间分辨率可达亚微米级别，为红外光谱在生物医学方面的应用提供了全新的视角。比如在阿尔茨海默病 (AD) 研究方面，AD的关键病理特征是淀粉样蛋白折叠，这些 β-折叠结构具有特定的振动特征，对于红外光谱来说十分敏感，但是受制于传统红外光谱仪本身的限制，在生物组织样品上直接测量非常困难。而非接触式的FL-PTIR技术却能够很好适用于这些样品，并且已经有多个小组通过实验证明了FL-PTIR能够应用于具有特殊化学敏感性的活细胞成像研究。

Craig Prater等人通过这项技术成功实现了荧光定位下的OPTIR红外观测，并且完成了对组织中单个病理结构内的 β-折叠结构进行结构分析、在脑组织的特定细胞和培养的原代神经元分析。首先，作者使用了12个月周龄的 APP/PS1 转基因小鼠的大脑切片，用淀粉样蛋白特异性发光共轭聚电解质探针mytracker R（Ebba Biotech，Solna，Sweden）进行标记，并用OPTIR进行观测β 折叠结构的分布。相比于传统红外很难定位的问题，FL-OPTIR通过宽场荧光能够快速定位淀粉样蛋白斑块。并直接在脑组织中评估其在单个斑块中的结构。通过 k 均值聚类方法对其进行分析，清楚地显示了在 1630 cm^–1处具有高振幅和低振幅的两组光谱的存在，并且具有 1630 cm^–1高振幅的光谱清楚地与荧光信号共定位。光谱分析表明 Amytracker 没有对酰胺 I 和 II 区域有明显的吸收，因此表明 Amytracker 可用于 OPTIR 测量的荧光引导。

图 2. FL-OPTIR 对脑组织中的淀粉样斑块进行成像荧光和红外图谱和热图的展示。

在第二个实验中，作者提供了一个概念性方法验证实验，证明 FL-OPTIR 可用于研究组织中的特定细胞类型，而这对传统红外显微光谱法来说十分具有挑战性。为此作者对脑组织中与淀粉样斑块相关的小胶质细胞进行成像，以评估它们的光谱特征，从而了解小胶质细胞是否可以将 Aβ 原纤维转化为单体的问题。这个实验使用 Aβ 特异性抗体 82E1 标记的 16 μm 组织切片，并用抗体 Iba1 对小胶质细胞进行了免疫标记。通过FL-OPTIR可以定位淀粉样斑块附近的小神经胶质细胞并测量 OPTIR 光谱。通过测量，发现 82E1 阳性小胶质细胞表现出β-折叠含量升高，表明小胶质细胞与 Aβ 原纤维相关。

图 3. 脑组织中淀粉样斑块周围小胶质细胞的成像。

在第三个实验中，作者研究了 FL-OPTIR 在培养的原代神经元中 Aβ结构成像的适用性。与组织研究类似，淀粉样蛋白的结构异质性使得研究神经毒性与 Aβ 结构之间的关系仍具有挑战性。因此，为了直接评估神经元中的淀粉样蛋白结构，作者使用FL-OPTIR技术基于荧光信号引导的光谱测量，发现远端比近端神经突部分（分支后）相关的 Aβ 包含更多的 Aβ-聚集体, 作者认为这些神经元隔室可能本质上更容易结合 Aβ或者能够主动运输到远端。

图 4. 初级神经元中 Aβ (1–42) 的结构成像。

总结：

新型成像方法FL-OPTIR 结合了荧光成像和红外光谱来描述生物组织内的结构变化。能够针对复杂系统中的特定细胞、细胞器和分子进行分析和检测，解决了生物标本中红外光谱定位困难的问题。能够直接在组织中定位和分析淀粉样蛋白和相关的小胶质细胞，这可以解决局部环境在 AD 进展中的作用，帮助识别与淀粉样斑块相关的小胶质细胞，并在亚细胞水平上直接研究小胶质细胞中的纤维结构。为复杂样品中的蛋白质和细胞进行红外光谱分析提供了新的测量方法，为红外在生物领域的应用提供更加便捷实验途径。

作为美国PSC公司在中国的代理，Quantum Design中国于2020年将非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统—mIRage系统引入国内，助力中国科研工作者取得一个又一个重大突破：

国内经典案例分享：

南京大学环境学院借助mIRage建立了一种新型的塑料表面亚微米尺度化学变化表征方法。该工作发表在知名期刊Nature Nanotechnology上。

中国农业大学借助mIRage成功实现对玉米粉中痕量微塑料的原位可视化表征。该工作发表在Science of the Total Environment上。

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