Nature materials/Adam J. Engler团队揭示干细胞分化过程中基质刚度与蛋白质束缚的相互作用

#干细胞分化#基质刚度#蛋白质束缚#

  干细胞通过与细胞外基质（ECM）的结合和收缩来调控自身的命运。ECM的刚度能够调控细胞的短期功能如细胞铺展，以及长期功能如干细胞和平滑肌前体细胞在二维平面上的表型变化。在二维环境中，共同的肌球蛋白介导的收缩机制对于基质诱导的分化至关重要。然而，在三维环境下，需要一种不稳定或可降解的基质，允许细胞首先铺展并随后与ECM黏附才能实现分化。力介导的ECM蛋白质展开也会随着刚度的不同而调控细胞反应。虽然构建三维基质已成为理解基质如何影响细胞命运的广泛方法，但在二维环境下，基底固定的纤维状蛋白质形变如何调控干细胞命运仍不明确。

  有研究提出，除了基质刚度和配体类型外，纤维蛋白与底层基底表面的耦合程度，即锚定和基质孔隙度，也会影响干细胞的分化。还有研究提出ECM提供的机械阻力，对抗肌球蛋白介导的收缩并引发细胞信号传导和分化，可能是由于蛋白质锚定而非基质刚度在平面培养中的作用。因此，有必要分离蛋白质锚定和基底刚度这两个因素，并确定它们是否以及如何共同调控干细胞分化。Adam J Engler团队 2014年10月在Nature materials发表题为“Interplay of Matrix Stiffness and Protein Tethering in Stem Cell Differentiation”的文章，该研究发现在二维平面上，基质刚度独立于蛋白质锚定和孔隙度，单独调控干细胞分化。

  首先，研究者通过调整丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联剂的比例产生三种不同刚度的水凝胶，分别对应脂肪组织、肌肉和类骨质的刚度，又调整丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺交联剂的比例改变聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的孔隙率，对比相似刚度每种水凝胶之间的体积和质量溶胀比的差异，发现每个基底亚组之间的孔隙率存在显着差异，表明水凝胶孔隙度与刚度无关。利用电镜扫描证明孔径随着丙烯酰胺浓度的增加和双丙烯酰胺浓度的降低而增加。接下来研究者将人脂肪来源干细胞(ASCs) 、骨髓间充质干细胞（MSC）培养在不同刚度的水凝胶上，碱性磷酸酶（ALP）染色的结果显示孔隙率并不影响两种细胞的分化，但刚度会明显影响两种细胞的分化。由于细胞-ECM信号传导依赖于收缩力，而且收缩力差异可以调控分化，接下来研究者利用牵引力显微镜（TFM）观察到相同刚度的水凝胶的平均位移相似，但不同刚度的水凝胶之间的平均位移不同，再次证明孔隙率和干细胞分化无关，刚度可能影响细胞分化。

  在合成水凝胶上培养细胞需要通过蛋白质-交联剂（如磺基-SANPAH）将细胞与粘附性基质蛋白（如Ⅰ型胶原蛋白）共价结合到水凝胶表面。为了调控纤维状胶原蛋白与PA水凝胶的锚定，研究者通过调整磺基-SANPAH浓度来改变表面锚定点密度，从而改变相邻锚定点之间的平均距离。通过使用抗Ⅰ型胶原蛋白抗体功能化的探针，在一系列磺基-SANPAH浓度下激活基底。当探针从表面收回时，胶原蛋白会逐渐展开或拉伸，直到抗体-蛋白键断裂,通过对力谱图进行分析，可以定位破裂事件，并确定破裂力（即打断蛋白质-抗体键所需的力）以及破裂长度（即胶原纤维段在破裂时的偏转量）。结果发现随着磺酸化-SANPAH浓度增加，破裂长度减小，且破裂力并未发生实质性变化。接下来研究者发现无论磺胺-SANPAH 浓度、水凝胶配方和细胞类型如何，在所有 30 kPa 水凝胶上均观察到细胞分化，说明胶原蛋白与基质表面的结合程度对干细胞的分化没有影响。为了进一步确认分化结果，研究者使用牵引力显微镜绘制了水凝胶在一系列磺基-SANPAH 浓度范围内的底物位移，结果显示嵌入水凝胶中的珠子的平均位移与磺基-SANPAH 浓度变化无关，仅取决于基质模量。随后研究者又利用一种来自纤维连接蛋白短的细胞粘附肽，通过在聚合过程中加入丙烯酸酯-PEG-RGD，使粘附蛋白直接结合到聚丙烯酰胺骨架中从而没有蛋白束缚力，在此条件下培养人脂肪来源干细胞(ASCs) 、骨髓间充质干细胞（MSC），发现在没有纤维蛋白束缚的情况下细胞依然会发生分化，说明束缚力与干细胞分化无关。

  接下来研究者为了证明在没有纤维蛋白束缚的情况下，刚度诱导的分化是可能的，通过在聚合过程中加入丙烯酸酯-PEG-RGD（而不是将粘附蛋白拴在底物上），直接掺入聚丙烯酰胺主链中，观察在没有蛋白质系链的情况下细胞在 PA-PEG-RGD 水凝胶上铺展情况，发现ASCs在10/0.3 ，30 kPa水凝胶上发生成骨分化，与RGD浓度无关，并且细胞产生的底物位移与胶原包被的水凝胶相似。为进一步确定这种现象的普遍性，又利用不同的基材二甲基硅氧烷 (PDMS)进行实验，调节其刚度同样可以观察到细胞黏附和扩散，并且细胞扩散面积在所有基底上相似，说明细胞可能在二甲基硅氧烷 (PDMS) 不同配方上感受到类似的机械信号。

  鉴于测量PDMS材料力学性能的方法缺乏共识，选择Z恰当的技术以精确模拟细胞与基底间的相互作用至关重要。细胞以20至120纳米/秒的速度对抗并拉动基底，导致的形变程度与基底刚度呈反比关系。为了模拟这些动态变化的拉力事件，研究者调整AFM探针的回缩速度以匹配细胞的拉动速度和焦点的大小，并通过分析AFM获得的回缩曲线（而非压入曲线）来实现这一点。当探针在表面上方拉伸并使材料发生形变时可通过拟合从接触点到达到-100 pN力值之间的线性区域来确定基底的刚度。结果显示100:1 PDMS具有高度粘弹性，而50:1 PDMS主要表现为弹性，两者在与细胞相关应变条件下都保持较高刚度，这与先前的研究结果一致。在细胞进行力学感知的尺度，无论是50:1还是100:1 PDMS基底，其刚度均高于30 kPa PA水凝胶，这一发现合理解释了为何细胞铺展和成骨分化不受固化比例影响。

  综上所述，该研究通过调节基质孔隙率而不改变聚丙烯酰胺凝胶的刚度，发现不同的基质孔隙率不会显著改变人类脂肪来源的干细胞和骨髓来源的间充质基质细胞的蛋白质束缚、基质变形或成骨和成脂分化。高达50倍的蛋白质-底物连接体密度的变化改变了蛋白束缚，但不影响成骨、脂肪生成、表面蛋白质展开或潜在的底物变形。细胞分化也不受蛋白质束缚的影响。该研究结果表明，平面基质的刚度独立于蛋白质束缚和孔隙率调节干细胞分化。

原文链接：https://www.nature.com/articles/nmat4051

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