Stellar高通量蛋白定量技术引领临床生物标志物检测新格局

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李珊

在发现潜在蛋白生物标志物之后，需要通过靶向蛋白组学定量技术在大生物样本量中，进行高通量、高准确性、可重复性的检测，来验证这些标志物。目前，靶向蛋白定量检测技术主要包括免疫分析和质谱分析。传统的免疫法如ELISA，存在目标物通量低、灵敏度有限、交叉反应等不足，一些新型免疫检测平台则存在成本和技术门槛高、新方法开发周期长等问题。质谱靶向检测主要包括基于三重四极杆的多反应监测（MRM）和平行反应监测（PRM）方法。与MRM相比，PRM的优势在于它可以通过单次扫描即可监测目标母离子的所有产物离子，无需在数据采集之前预先设计母子离子对，简化了方法开发工作流程，并且可提高检测灵敏度。Heil等¹在Orbitrap Eclipse质谱仪上多次测量126个血浆蛋白中的432个肽，在高分辨率Orbitrap和单位分辨率线性离子阱（LIT）之间交替进行分析，发现两种质量分析器具有相似的技术精度，并且线性离子阱的优越灵敏度使其在超过62%的肽中测得更低的定量下限。

图1. Orbitrap与LIT PRM检测对比

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下面我们一起来看看Stellar发布以来在靶向蛋白质组学方向的应用研究报道结果。

Remes等²对比了血浆基质中786条多肽的三重四极杆和Stellar质谱靶向定量检测结果，发现与MRM检测结果相比，Stellar PRM检测的定量下限（LOQ）和检测下限（LOD）分别提高了~10倍和~2倍，展现出更高的灵敏度。

图3. MRM和Stellar PRM检测结果对比

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Plubell等³利用Orbitrap OE480或Stellar质谱建立基质样本GPF-DIA蛋白组学谱图库；通过集成在skyline软件中的PRM Conductor工具优化每个precursor的色谱和质谱参数，以及筛选precursor的m/z和相对保留时间；利用引入Adaptive RT功能的Stellar质谱仪进行筛选后precursors的PRM检测，开发了利用Stellar进行生物液体样本高通量靶向蛋白检测的方法（图4）。在神经退行性疾病病人来源的脑脊液样本中进行基于前期研究和GPF-DIA筛选得到的共101个蛋白（1070个precursors）的PRM检测，通过Tau、APOE4等明确与AD相关的蛋白检测结果验证了实验的可信度（图5）；另外对病人血浆样本进行直接基于GPF-DIA筛选得到的共723个蛋白（2096个precursors）的PRM检测，并成功验证出已报道的PD相关差异（图6）。

Wahle等⁴开发报道了基于Orbitrap Astral的DIA数据建立Stellar PRM方法的分析策略（图7），以及利用¹⁵N标记蛋白在Stellar质谱上开发蛋白panel的准确定量方法（图8），使包括翻译后修饰和突变在内的蛋白质形态的研究成为可能，展示出Stellar在靶向蛋白质组学检测方面的能力和潜力。

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