【应用聚焦】生物样品的实验室制备

实验室中常常用细胞裂解来破坏细胞膜和细胞壁，以释放细胞内的组分，如蛋白质、核酸和其他生物分子。细胞裂解可以通过多种方法实现，包括物理方法（如超声波、冷冻研磨）、化学方法（使用裂解缓冲液）和酶法（使用溶菌酶等）。值得注意的是，细胞内的敏感分子，如蛋白质和酶，对温度非常敏感，高温可能导致它们变性或失活。因此在使用物理裂解方法时，常常需要低温研磨来保护这些分子免受热损伤，确保它们的结构和功能完整。在这种情况下，低温使细胞群和细胞壁脆化，使它们更容易破坏并减慢细胞片段的后续分解。

冷冻混合球磨仪经常被用于均质化生物样品。用小玻璃珠进行研磨是一种用于酵母菌、微藻或细菌类样品的细胞破碎既定方法。在这个过程中，样品仅会适度升温，而通过预冷方式可将其升温效果降至最低。 

MM 400可以对多达240毫升的细胞悬浮液进行有效的细胞破碎，以提取DNA/RNA和蛋白质。为了准确诊断感染，可以通过使用适配器从8 x 30毫升样品瓶或10 x 5毫升试管的组织中分离出完整的细菌。

对于粉碎25至30克的植物材料，如大麻花，锥形离心管（Falcon管）是最适合的。如果要均质处理缓冲溶液中的新鲜肝脏样品，可以用钢球或氧化锆球在50毫升的Falcon试管中进行，最高可支持多达8个组织样品。为了尽可能降低破坏Falcon管的机械应力，建议减少工作频率和提高样品填充量，例如多用缓冲液和多加样品。

应用实例——从毛发中提取皮质醇

毛发检测是一种使用人体毛发作为样本进行的生物检测方法。通过分析毛发中的化学物质，如药物、药物代谢产物、重金属、激素等，毛发检测可以提供个体过去一段时间内的生理状态、环境暴露、药物使用历史等信息。与血液和尿液检测相比，毛发检测具有更长的检测窗口，因为毛发的生长速度较慢，毛发中的化学物质可以长期保留。下文中，我们以猕猴毛发样品中提取皮质醇为例，来说特殊生物样品的制备。

糖皮质激素是一种应激激素，可以调节糖、蛋白质和脂肪的代谢，提高机体对伤害性刺激的抵抗力，在动物生存中起到了相当重要的作用。皮质醇是人类和非人灵长类糖皮质激素的主要成分。因此，皮质醇通常用作衡量动物受到的应激刺激的大小的指标。毛发样品是一种很好的选择，血液里的物质可以通过毛细血管渗透到毛囊细胞，最后扩散到毛发里。因此，从毛发中可以提取出皮质醇来进行具体的实验研究。

样品粉碎是提取毛发皮质醇非常关键的一步，起初为剪碎，将样品放入液氮内充分冷冻变脆后，再用MM400进行研磨，这样既可以使研磨粉末更细、更均匀，又可以避免研磨过程中局部高温对样品造成的影响。具体步骤如下：

• 称取 500mg 毛发样品置于 15 mL玻璃试管中，加入10ml 异丙醇。在室温下将该试管放于调速多用振荡器上洗涤 3min，共洗涤 2 次；洗涤后的样品置于电热恒温干燥箱内，37℃干燥 8h；

• 干燥后将样品放入 80ml 小烧杯内，用手术剪剪碎。之后放入 25ml 不锈钢研磨罐内，拧紧后将罐放入液氮内冷冻至液氮停止沸腾。将研磨罐装入冷冻混合型球磨仪MM400研磨 2.5min；

• 称取400mg 毛发粉末置于10ml 离心管内，并加入8 ml甲醇。室温下，将离心管置于振荡器，振荡 24h提取皮质醇；

• 将离心管离心5min并取4ml上清液移入5ml离心管内。在5ml 离心管内取 2ml上清液放入2ml离心管，室温用氮气流进行干燥，样品干燥后，加入5ml离心管内的剩余样品，继续干燥;

• 干燥后加入 0.5ml PBS (磷酸缓冲液)对样品进行重构。振荡混匀后放入?20℃ 冰箱内储存至检测日。

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