SEC-MS法测定双特异性抗体精确分子量

双特异性抗体（bsAbs）又称为双功能抗体，作为一种新型单克隆抗体，正在生物ZL领域兴起。它可以识别两个不同的抗原表位，这种双重特异性使其比普通的单克隆抗体具有更好的治LX果。

双特异性抗体可以将T细胞重新导向肿瘤细胞、同时阻断两个不同的信号通路、针对不同疾病介质的双重锚定，并传递特定药物到目标位点。目前，有超过50个双特异性抗体产品已进入临床评估阶段。

对双特异性抗体进行精确表征是确保药品安全及功效的重要前提。尺寸排阻色谱串联质谱（SEC/MS）作为一种分析手段，正越来越多地被应用于确定双特异性抗体等的生物大分子的精确分子量。

本篇应用介绍了使用粒径2 μm 的超GX液相SEC色谱柱 TSKgel UP-SW3000对一个双特异性T细胞衔接系统 (BiTE^®) 进行SEC/MS分析。这个BiTE是由两个单链抗体 (scFv) 通过一条非免疫原性5-氨基酸链重组连接构成。

图1.双特异性T细胞衔接系统（BiTE^®）的结构

分析条件

色谱柱: TSKgel UP-SW3000（2 μm, 4.6 mm ID × 30 cm）

HPLC仪器: Nexera^® XR UHPLC

MS质谱仪: Q Exactive™ Plus

流动相: 20 mmol/L醋酸铵+10 mmol/L碳酸氢铵（pH 7.2）

梯度: 等度

流速: 0.35 mL/min

检测: UV@280 nm

温度: 30 ºC

进样量: 5.0 μL

样品: BiTE, 0.3 mg/mL (Creative Biolabs) 、parent mAb shown, 0.5 mg/mL (Creative Biolabs)

电离模式: 电喷雾电离, 正离子模式

MS模式: Scanning, m/z 800-6000

结果与讨论

分别将分子量为~55 kDa 的BiTE和~150 kDa的亲本抗体进样到TSKgel UP-SW3000色谱柱中进行分析。图2和图3分别是BiTE和其中一条亲本抗体的(a)总离子色谱图、(b)质谱图、(c)解卷积质谱图。

分析结果表明，在质谱兼容的流动相条件下，通过SEC/MS分析确定了BiTE的精确分子量为54.1 kDa、亲本抗体的分子量为149.3 kDa。

图2. SEC/MS分析BiTE的精确分子量

图3. SEC/MS分析亲本抗体的精确分子量