核糖体打靶载体电转染肝细胞条件的优化

一、引言

二、材料与方法

（一）材料

1. 细胞
   人肝细胞系（如 HepG2 细胞），培养于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素的 DMEM 高糖培养基中，置于 37°C、5% CO₂培养箱中培养。

2. 载体
   构建好的核糖体打靶载体，带有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因，用于监测转染效率。

3. 电转染设备
   电转仪（型号 [具体型号]），配备不同规格的电转杯。

4. 其他试剂
   电转染缓冲液（如 Opti - MEM）、胰蛋白酶、台盼蓝等。

（二）实验方法

1. 细胞准备
   （1）将 HepG2 细胞接种于不同规格的培养皿中，设置不同的初始细胞密度（如 1×10⁵、2×10⁵、5×10⁵个 / 皿），培养至不同的汇合度（如 50%、70%、90%）。
   （2）用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，用 PBS 洗涤两次，然后重悬于不同的电转染缓冲液中，调整细胞浓度至合适范围（如 1×10⁶ - 1×10⁷个 /mL）。

2. 电转染参数设置
   （1）设置不同的电压值（如 100V、200V、300V）、脉冲时间（如 5ms、10ms、20ms）和脉冲次数（如 1 次、2 次、3 次），采用不同规格的电转杯（如 0.2cm、0.4cm 电转杯）。
   （2）将重悬后的细胞与核糖体打靶载体混合（载体用量根据前期预实验确定），加入电转杯中，按照设定的电转染参数进行电转染。

3. 转染后处理
   电转染后的细胞立即转移至预热的完全培养基中，置于 37°C、5% CO₂培养箱中继续培养。在不同时间点（如 24 小时、48 小时、72 小时）观察细胞状态，并用荧光显微镜检测 GFP 阳性细胞比例以评估转染效率，同时采用台盼蓝拒染法检测细胞存活率。

三、结果

（一）细胞密度和汇合度对转染效率和存活率的影响

（二）电转染参数的影响

1. 电压
   在电压为 200V 时，转染效率达到峰值，而过高的电压（如 300V）会导致细胞大量死亡，转染效率反而降低。这表明合适的电压对于维持细胞完整性和促进载体进入细胞至关重要。

2. 脉冲时间和脉冲次数
   脉冲时间为 10ms、脉冲次数为 2 次时，转染效果较好。较短的脉冲时间可能无法使载体充分进入细胞，而过长的脉冲时间或过多的脉冲次数会对细胞造成不可逆的损伤。

3. 电转杯规格
   0.2cm 电转杯在本实验条件下表现出更好的转染效率，可能是由于其更适合小体积的细胞 - 载体混合液，能够更均匀地分布电场。

（三）缓冲液和温度的影响

1. 缓冲液
   Opti - MEM 缓冲液相比其他常用缓冲液，能显著提高转染效率和细胞存活率。其特殊的成分可能有助于维持细胞在电转染过程中的生理状态。

2. 温度
   在电转染过程中，保持电转杯和细胞 - 载体混合液在室温（25°C）时的转染效果优于在低温（4°C）或高温（37°C）条件下。室温可能有利于电场与细胞的相互作用，减少温度对细胞的应激损伤。

四、讨论

（一）细胞状态的重要性

（二）电转染参数的优化机制

1. 电压与细胞膜通透性
   电压是影响电转染的关键参数之一。合适的电压能够使细胞膜暂时形成可逆性的小孔，允许载体进入细胞。当电压过高时，细胞膜会受到严重破坏，导致细胞死亡和内容物泄漏，从而降低转染效率。这种细胞膜通透性的改变是一个复杂的物理过程，与细胞膜的脂质双分子层结构和电场强度密切相关。

2. 脉冲时间和脉冲次数与载体进入细胞的效率
   脉冲时间和脉冲次数协同作用影响载体进入细胞的效率。适当延长脉冲时间和增加脉冲次数可以增加载体进入细胞的机会，但过度的操作会对细胞造成累积性损伤。这可能是由于长时间或多次的脉冲会引起细胞膜的过度穿孔和细胞内环境的紊乱，影响细胞的正常代谢和功能。

3. 电转杯规格与电场分布
   电转杯的规格影响电场在细胞 - 载体混合液中的分布。较小规格的电转杯能够产生更均匀、更强的电场，使每个细胞受到更一致的电刺激，有利于载体均匀地进入细胞。而较大规格的电转杯可能导致电场分布不均匀，部分细胞受到过高或过低的电场强度，影响转染效率。

（三）缓冲液和温度对转染的影响

1. 缓冲液成分与细胞保护
   Opti - MEM 缓冲液中的成分可能对细胞在电转染过程中起到保护作用。它可能含有一些能够稳定细胞膜、调节细胞内离子浓度的物质，减少电转染对细胞的损伤。此外，缓冲液的渗透压等物理性质也会影响细胞的生理状态，进而影响转染效率。

2. 温度与细胞应激反应
   温度在电转染过程中对细胞的应激反应有显著影响。室温条件下，细胞的生理活性和细胞膜的稳定性处于一个相对平衡的状态，有利于电转染的进行。低温可能会使细胞膜变得僵硬，降低其对电场的响应性，而高温则可能加速细胞的代谢和应激反应，使细胞更容易受到电转染损伤。

五、结论