『NEW』微量荧光光谱测量应用说明

利用FluoTime光谱仪进行微体积荧光光谱测量

Eugeny Ermilov, Maria Loidolt-Krüger, Bita Rezania

PicoQuant GmbH, Rudower Chaussee 29, 12489 Berlin, Germany, info@picoquant.com

在科学研究和诊断中，效率、灵敏度和成本效益都很重要。对更精确结果的需求与日俱增，加上需要保存珍贵的患者样本并尽量减少试剂的使用和浪费，这是对包括细胞培养和微生物学等跨学科实验室的一场挑战。

能够精确检测小容量样本中低浓度分析物的高灵敏仪器有助于应对这些挑战。在本应用说明中，我们使用 FluoTime 250 荧光寿命光谱仪展示了对微量荧光光谱和荧光寿命的测量。FluoTime 250荧光寿命光谱仪，可应用于一系列任务，包括核酸分析、蛋白质分析、荧光底物酶分析、荧光离子指示剂、代谢物定量和免疫分析。值得一提的是，FluoTime 300也可以进行同样的实验。

我们的方法强调尽量减少样本消耗，确保细胞培养物、微生物培养物和患者样本等珍贵样本得到有效利用。此外，我们的方法旨在优化试剂的使用，同时不影响性能，从而降低与实验室分析相关的总体成本。此外，我们的策略还优先考虑减少浪费，在保持实验数据的质量的同时，促进实验室的可持续发展。

在其他分析技术中，稳态和时间分辨荧光光谱可用于物质的鉴定、定量和纯度评价。

稳态发射光谱的特点是操作简单、应用广泛。通过分析发射光谱，研究人员可以根据物质独特的荧光特征对其进行识别。这种技术广泛用于各种化合物的鉴定和检测，包括荧光团标记的生物分子、环境污染物和药物。

此外，发射光谱还是评估物质纯度或材料质量的可靠工具。荧光光谱的差异可以表明样品中存在污染物或结构的改变。

时间分辨荧光光谱技术是对稳态发射技术的一种复杂扩展。通过测量脉冲激发后荧光发射随时间的衰减，研究人员可以提取有关样品的动力学信息。

荧光寿命衰减是每种荧光团及其所处环境的特征，因此可用于识别和补充光谱信息。

此外，这种方法在涉及环境敏感的荧光团的应用中特别有价值，在这些应用中，环境的变化，如pH、温度、各种离子浓度或粘度，会影响荧光寿命。通过利用荧光寿命对环境变化的敏感性，研究人员可以设计出能够定量测量生物和环境样品中离子浓度的传感器。这种能力为具有时间分辨率的实时监测开辟了道路。

FluoTime 荧光寿命光谱仪系列（FluoTime 250 和 FluoTime 300）因为它使用方便、采集速度快、维护简单，使这些技术的获得更加容易。

所获得的荧光素在乙醇中的荧光发射光谱如图1所示。原始光谱（底部）清楚地显示，与100 nM样品相比，从稀释4000倍的25 pM样品中收集到的荧光信号大幅下降。然而，在405 nm的激发下，发射光谱的形状非常相似，这一点可以在归一化后看到（左上角）。这表明FluoTime 250具有极高的高灵敏度。

在440 nm激发后，在25 pM样品的发射光谱中清晰可见一个约500 nm处的大拉曼峰（右上）。这就突出了选择适当激发波长的实际必要性，以尽量减少荧光和拉曼信号的光谱重叠。幸运的是，FluoTime 250 提供了这种灵活的配置。

由于使用了脉冲激发激光和时间分辨检测，我们还可以获得荧光寿命。图2显示了两种浓度的荧光素在405 nm（左）或440 nm（右）激发，并在516 nm处检测的荧光衰减。我们可以对衰减进行尾部拟合或再卷积拟合，以获得荧光寿命。荧光素在乙醇中的荧光寿命约为 4.3 ns。

在所有条件下测得的荧光寿命都非常吻合，这说明即使在低信号水平下，这种方法也是稳健可靠的。

在25 pM荧光素 采用440 nm激发后的荧光寿命衰减中，拉曼信号也是可见的，在衰减曲线的起始处急剧下降。通过进行再卷积拟合，在分析实验数据时可以很容易地将这种效应作为“散射光 ”考虑在内。