质粒DNA纯化迷雾重重，这些关键要点你知晓几何？

质粒纯化又称为质粒分离或质粒 DNA 分离，是指从细菌细胞中提取和纯化质粒 DNA，使科研人员获得高度浓缩和纯化的质粒形式，以便进一步分析和实验。质粒纯化的关键步骤通常包括细菌细胞裂解、去除细胞碎片、结合质粒 DNA、清洗、洗脱质粒 DNA 以及根据下游应用的可选附加步骤。

质粒纯化至关重要，因为质粒DNA（pDNA）是基因工程中的基础工具，支持克隆、基因表达研究和治疗开发等应用。高质量的质粒DNA对于确保关键下游项目（如疫苗生产、细胞和基因治疗）的准确性和可靠性至关重要，有助于推动科学突破。

质粒纯化有两个主要考虑因素：制备规模和纯度等级。这两者直接影响到下游应用的成功与否。从小规模研究到大规模治疗生产，常规的分子实验，一般对内毒素没有严格要求，转染实验对内毒素含量有要求，这些因素以及适当的纯度/内毒素水平——有助于确保获得适量的质粒DNA，从而实现可靠且可重复的预期结果。

质粒有不同的大小，包括小型（1–10 kb）、中型（10–50 kb）和大型（>50 kb）。质粒生长培养基，如LB肉汤、Terrific Broth (TB)、SOC培养基和2xYT，对于培养含有质粒的细菌细胞至关重要。这些营养丰富的培养基可以提高质粒产量，尤其对于大型质粒，优化细菌生长条件，并提高转化效率。

根据不同的菌液量，质粒提取试剂盒有小提，小中提，中提，大提；这些试剂盒又分为去内毒素和不去内毒素提取。

• 分子级：提供了速度和成本效益，使其非常适合克隆、核酸标记、PCR 和测序等稳健应用，

• 转染级：专为需要更高纯度和更高产量的应用而设计，例如标准细胞系的转染和体外转录

• 高级转染：如转染敏感细胞系或体内研究，推荐采用高级转染级质粒分离技术。

• 菌种活性不佳：如菌种保存时间过久，质粒可能丢失，建议培养前先划线活化，以稳定产量；如大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等），建议重新涂板培养后挑选新菌落进行液体培养； 

• 未充分裂解细菌：细菌需充分重悬，成团的细菌会因无法裂解降低产量；

• 裂解时间过长：导致质粒断裂，降解；

• 质粒本身拷贝数低：载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液产量为3-16μg）；长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5-2μg；低拷贝质粒可以增加起始菌液量来提高浓度；

• 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

翌圣生物科技（上海）股份有限公司成立于2014年，是一家聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事核苷酸、蛋白、细胞和类器官四大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业。公司兼备核心技术自主研发和规模化生产能力，核心产品数量达数千种，覆盖分子克隆、qPCR、NGS、体外转录、抗体、蛋白纯化及分析、细胞培养、转染、报告基因检测和类器官等多种系列，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。