吸光度测量的技术与窍门

2025-01-07 09:02:40 42阅读次数

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吸光度可提供有关各种物质状态下材料化学成分的信息。将吸光度作为一种定性技术来鉴别物质，或作为一种定量技术来确定溶液中分子的浓度，广泛应用于环境监测、食品检测、生物医药等领域。

一、吸光度的重要性

为什么选择吸光度？吸光度测量提供有关材料化学成分的宝贵信息。入射到样品上的光可以透射、吸收或散射。吸光度测定是一种重要的技术，应用范围广泛，尤其是在生物医学和生命科学领域，研究人员、开发人员和工艺工程师将吸光度技术应用于从蛋白质分析到即时诊断的挑战。

光谱仪测量精度的一个指标是其吸光线性度。根据比尔定律，溶液吸收特定波长的光后，会在该波长处产生一个吸光峰，其强度随溶液浓度的变化而线性变化。例如，如果溶液浓度增加一倍，吸光峰的高度也会增加一倍。因此，当我们描述光谱仪在 2 AU（吸光度单位）范围内具有吸光度线性时，这表明超过 2 AU，样品浓度与吸光度峰值之间的关系就会中断（不再是线性关系）。这种分解与检测器噪声和杂散光等限制因素有关。

具有高吸光度线性度的光谱仪可让用户：1）在广泛的浓度水平范围内精确测量样品；2）无需进行高强度的样品稀释步骤，以免在测量过程中产生误差。这对于需要非常高的测量精度、需要比较不同实验结果或样品量有限的应用来说至关重要。

二、吸光度测量的步骤

吸收度可作为一种定性工具来识别物质，或作为一种定量工具来测量溶液中的分子浓度。利用模块化光谱仪，用户可以选择最适合其测量的波长范围和分辨率，并可在实验室或现场设置之间进行切换。此外，还提供预先配置的吸光度测量包。选择吸光度设置后，请遵循以下四个步骤以确保获得最佳结果：

1）优化您的光谱仪设置

设置光谱仪积分时间，使最大原始信号为满刻度的约 80%，并使用可容许的最高光谱平均值。保持 Boxcar宽度与光谱仪的像素分辨率大致相同，否则会影响光谱分辨率。

2）确保准确的参考测量

首先，让光源达到热平衡，从启动开始可能需要长达 30 分钟的时间。获取参考后，在透射模式下查看生成的频谱。如果已存储准确的参照，则参照溶液的透射率应为 100%，并在该值附近有一些光谱噪声。噪声较多的波长区域表示测量精度最低的波长（通常是最短和最长的波长，或光谱的“边缘”）。

3）进行有效的暗测量

进行暗测量时，请阻挡光源处的光线。关闭并再次打开光源会影响其热平衡，需要新的参考测量。或者，许多比色皿支架都有一个滤光片槽，可以阻挡光线。使用 100% 不透明的金属或物体。纸张，甚至是纸板，都可能具有欺骗性的传输效果，并且只需要非常低的光线水平即可影响测量。

4）防止污染您的采样装置

确保比色皿的所有表面干净，没有指纹、灰尘和污垢。用用于样品的溶剂或缓冲溶液填充比色皿，并检查是否有气泡。此外，在使用透射浸入式探头或流通池时，请注意检查气泡，因为这些设备容易出现气泡误差，尤其是在较短的光程下。

三、吸光度测量的技巧

吸光度测量获取最佳参考光谱和暗背景光谱是非常关键的。

要进行最佳参考测量，首先让光源达到热平衡（在某些情况下可能需要长达 30 分钟）。确保比色皿或采样光学元件的所有表面都干净且没有指纹、灰尘和污垢。用要用于样品的确切溶剂或缓冲溶液填充比色皿，并检查是否有气泡。如果您使用的是透射浸入式探头或流通池，检查是否有气泡尤为重要，因为这些设备容易受到这种误差源的影响，尤其是在较短的光程下。

四、如何确保可靠的吸光度测量结果

当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被物质吸收程度的一个物理量。吸光度测量的简便高效，因此被广泛应用于液体和气体的光谱测量技术, 集成至工业测试系统，还可以用于科研分析。那么，您在测量吸光度时，是否遇到过以下问题：

为什么基线降到零以下？
为什么吸光度值为负数？
为什么标准曲线的相关性如此差？

液体浓度与吸光度值相关性较差的标准曲线示例

答案可能在这个不起眼的系统配件中。比色皿支架：Square One比色皿支架

Square One比色皿支架可容纳1cm光程的比色皿。每个支架包括三个带有光纤耦合器的准直透镜，一个提高荧光信号的透镜，一个遮挡环境光的盖罩及两个滤光片支架(可同时容纳直径为12.5和25mm的滤光片)。同时，它能很好地与海洋光学的光谱仪、光源、光纤连用，是做吸收、透射、荧光测试的理想选择。

为测试其可重复性，我们进行了10次吸光度测试，每次检测都把比色皿从比色皿支架上拆卸下来再以相同的方式安装上去。无论使用石英比色皿还是一次性塑料比色皿，所产生的光谱都具有很好的一致性。将装有稀释的绿色食用染料的石英比色皿取出并在比色皿支架中更换10次，光谱几乎完全重叠，在410 nm处的平均吸光度为0.47AU，标准偏差仅为0.0007AU。