肉类颜色测量指南之新鲜肉中的肌红蛋白氧化还原形式

肉类颜色测量指南

新鲜肉中的肌红蛋白氧化还原形式

反射率测量与眼睛和大脑感知密切相关。通过这种非破坏性采样方法，可以在同一样本上进行多次随时间变化的测量。此外，该程序快速且易于操作。

然而，由于反射率测量受肌肉结构、表面湿度、脂肪含量、色素浓度、pH值及其他固有肌肉特性等因素影响，需要格外注意细节。本节概述了特定肌红蛋白形式的定量分析。

目前有两种反射率法可用于定量肌红蛋白氧化还原形式。第一种方法通过表面反射率计算各氧化还原形式在等波长下的 K/S 比值（Francis和Clydesdale，1975）。第二种方法采用选定波长与校正因子（Krzywicki，1979），通过计算脱镁肌红蛋白（DMb）和镁镁结合肌红蛋白（MMb）的百分比，并以100%为基准确定氧化肌红蛋白（OMb）的含量。

估算DMb、OMb和MMb（以及相应的血红蛋白形式）对肉类色素稳定性的基础研究至关重要。不过，Ledward（1970）指出，通过反射率估算的色素化学形态准确度仅±6%或7%。 AMSA 网站上可获取DMb、OMb、COMb和MMb的数码照片。

A. K/S方法用于等波长测量

在等波长点（即三种肌红蛋白形式中两种或以上具有相同反射率的波长，参见图9.1）处测量的肉样表面反射率，需转换为 K/S 值（计算方法详见C节，Judd和Wyszecki，1963）。将反射率转换为 K/S 值能提升数据线性度，同时有助于校正肉品的散射特性（S =散射系数）和吸收特性（K =吸光系数）（Francis和Clydesdale，1975）。样本的 K/S 值需代入方程计算，这要求必须预先确定三种主要肉品色素形式100%的参考值。需注意的是，每种100%肌红蛋白形式的 K/S 参考值会因实验条件、包装方式、样本特性及仪器差异而有所不同。因此，研究人员应通过实验样本自行测定100%参考值，而非直接采用已发表的数值。

B.创建“100%”肌红蛋白氧化还原形式作为参考标准

要定量测定肉品表面肌红蛋白氧化还原态的含量，必须获取各色素形态在等比波长处的分光光度反射值（图9.1）。由于不同氧化还原态之间可快速相互转化，制备由“100%”去肌红蛋白（DMb）、氧化肌红蛋白（OMb）、微氧化肌红蛋白（MMb）或完全氧化肌红蛋白（COMb）组成的参考标准品并非易事，需特别注意。这些形态可通过化学诱导或调节氧分压来实现。扫描100%标准品时，所有样本都应使用同一包装膜进行扫描，以消除反射率变化的潜在干扰源。 若样本充足，建议专门留出整块肉样（如肉排或牛排）用于色素形态检测。

1. 与肌红蛋白。 选择以下方法之一。

a. 化学诱导处理：将样本浸入1.0%铁Potassium cyanide溶液1分钟，沥干后用布吸干表面，用透气膜封装后置于2-4℃、1%氧气环境中氧化48小时或更长时间，以最大限度形成MMb后再进行扫描。若肉类为“新鲜”状态，MMb可能仅在表面及浅层形成，因此无法获得最完整的反射扫描图像。建议选用死后较久的肉类进行处理，因其固有的还原活性较低。

b. 氧分压调控：建议从DMb状态的肉开始操作。与完整肉相比，绞肉中高铁肌红蛋白的形成速度通常更快（可能由于耗氧量更高和/或MMb还原程度更低）。将肉置于氧气阻隔袋中，以1%氧气和99%氮气的混合气体环境，在室温（约20℃）下储存6小时；随后测量袋内氧含量（目标是将组织氧含量降至1%，该过程在较高温度下会更快完成）。若

新鲜肉中肌红蛋白氧化还原形式的定量方程式

当残留氧含量低于1%时，需通过以下步骤提升：使用自密封隔膜、注射器和细针，向氧气阻隔袋注入已知体积的大气空气（氧气浓度约20.6%）。根据袋体容积和已知氧浓度，运用公式（袋容积×袋内残留氧浓度）调整至[目标容积×目标氧浓度（1%）]。若氧浓度超过1%，需进行额外冲洗。建议采用3：1或更高的气体与肉类比例，以防止储存期间肌红蛋白降解。肉类初始吸收的氧气越少，转化效率越高；应定期检测并调整残留氧浓度。需维持至少1%的氧浓度。

需在4°C环境下静置48小时或更长时间，以确保完全形成100%的成熟肌红蛋白（MMb）。当色素完全转化后，重新用透气薄膜包裹并扫描检测MMb含量。使用储存或陈化且肌红蛋白还原酶活性较低的肉类，可加速MMb的形成。新鲜肉类可能需要长达一周时间才会变褐。储存期间需密切监测氧气浓度及褐变进程。

c. 为将混合物中的色素转化为MMb，需将肉块装入袋中，用擀面杖压平（擀面杖厚度需薄到足以让改良气体渗透超过肉块厚度的50%），抽空袋内空气后充入100%氮气，按前述方法将残留氧含量调整至1%。将袋子单面朝下存放进行色素转化。转化进行到一半时，将改良气体包装袋翻转，使肉块另一面暴露于气体环境中。在4℃环境下放置48小时后，重新用透气膜包裹，并对多个表面进行MMb检测扫描。

2. 去氧肌红蛋白。 选择以下方法之一。

a. 化学诱导法：将尺寸一致的样品浸入0.15%的二硫代硫酸钠溶液中将样品置于室温（约20°C）下静置1-2分钟，排液后用吸水纸吸干表面，进行真空包装，随后在20°C环境中静置1-2小时以最大限度转化为DMb。使用与第1、3节检测肌红蛋白形态时相同的透氧薄膜重新封装，并立即进行扫描。研磨后的产物可置于烧杯中的滤网支撑。

b. 氧分压调控：在样品内表面制备新鲜切面，确保其脱氧肌红蛋白含量基本达到100%，并立即进行扫描，通常仅需一次即可完成。由于脱氧肌红蛋白难以在100%浓度下稳定保留。

c. 或者与步骤2b联合操作：将样品置于高阻氧真空袋中进行真空包装（需使用极高真空度以最大限度减少残留氧气），并在4℃环境下保存24至48小时。OMb向DMb的转化可能较为缓慢，特别是在-1至4℃温度区间。若将样品在20℃条件下保持至少50%的时间，可促进OMb向DMb的更完全转化。通常情况下，由于氧气分压较低，OMb会优先转化为MMb，随后MMb会逐渐转化为DMb。若仪器已使用覆盖瓷砖标准的阻氧膜进行标准化，可直接扫描真空包装膜以减少OMb生成。但若研究人员希望保持三种肌红蛋白形态的膜层一致性，则需使用覆盖标准膜的透气膜进行标准化。此时应立即从真空包装中取出样品，覆盖透气膜并马上进行扫描。

3. 氧合血红蛋白。

a. 氧气分压调控：将先前保存在0至2℃环境中的样品置于高氧环境中（如弹式量热仪或改良型气氛包装袋），用70%至100%的氧气冲洗后，于0至2℃条件下储存24至48小时。取出样品后立即进行扫描。若样品采用高氧改良气氛包装，需确保气体与肉体积比至少为3：1。对于研磨产品，应采用薄层包装以促进改良气氛包装袋中的氧气吸收。

b. pH值越高，就越难获得最大开花（充氧）。

c. 储存温度越低，氧与肌红蛋白的结合就越强，因为酶对氧的竞争越少。

4. 羧基肌红蛋白。

a. 使用CO时需谨慎。

b. 建议从处于DMb状态的肉类开始处理，因为CO不太可能与OMb和MMb结合。例如，真空包装或使用除氧剂的肉类效果更佳，因为微量氧气就能延缓COMb的形成。

c. 在填充已知浓度的气体后，应立即对包装的顶空进行预混处理（使用指定浓度的一氧化碳）或注入计算量的纯一氧化碳。随后将肉品置于改良气体环境中储存，该环境含0.4%至1.0%的一氧化碳，余量为氮气或二氧化碳与氮气的混合气体。

d. 在测量表面形成的COMb之前，应将包装储存

需在4℃条件下持续2至3天，以促进氧气（及有机物）的去除，并使金属有机物完全还原为金属有机化合物，从而确保表面约100%的色素转化为共价有机物。

c. 通过K/S比值计算肌红蛋白形式

当肌红蛋白完全转化为四种色素形态后，需分别记录474、525、572和610纳米波长下的反射率数据。虽然理想情况下所有扫描应使用同一包装膜，但实际操作中可能因制备方法不同而无法实现。随后使用以下公式将反射率百分比转换为 K/S 值：

K/S =（1−R）（1−R）÷（2R），

其中R表示反射率百分比（需以小数形式呈现）。例如当反射率为30%时，取0.30代入计算，K/S 值应为0.8167。由于多数反射率仪器仅以10纳米为间隔记录数据，因此需通过积分法计算：474纳米处使用470和480纳米波长积分，525纳米处使用520和530纳米波长积分，572纳米处使用570和580纳米波长积分。首先通过积分法计算各波长的反射率值，再将其转换为 K/S 值。

将这些100%的参考 K/S 值与样品 K/S 值代入相应公式后，即可计算出样品表面的脱镁

肌红蛋白（DMb）、脱镁肌红蛋白（OMb）或脱镁肌红蛋白（MMb）的百分比。关于肌红蛋白形态的估算公式，Hunt（1980）曾做过系统总结。文献中关于脱氧肌红蛋白和MMb的测定方法屡见不鲜，而脱镁肌红蛋白的百分比通常通过100%的差值来确定。不过，由于脱镁肌红蛋白含量与消费者偏好密切相关（Hunt），更推荐直接使用610纳米波长进行测定（Mancini等，2003），因为该波长对DMb和MMb都具有等比特性。

（Kropf，1988）。在计算DMb、OMb和MMb的百分比时，其总和可能不等于100%。若出现这种情况，可参考Mancini等人（2003）提出的处理方法。在许多即食包装产品中，可通过添加乳酸等多种成分进行改良。由于肉类的反射特性可能受盐分及其他成分影响（Lamkey等，1986；Swatland和Barbut，1999），因此需要为每种肌红蛋白形态的100%含量建立参考标准，并进行方程式依赖性计算。为最大限度提高改良产品表面肌红蛋白氧化还原形态的估算精度，应专门从改良产品中提取100%去甲肌红蛋白（DMb）、去甲肌红蛋白（OMb）和肌红蛋白（MMb）的参考标准（Ramanathan等，2010）。

目前尚无可用于估算肉表面COMb的反射率测量方法。不过，暴露于一氧化碳的牛排光谱特征显示，COMb在500纳米处存在反射峰，且在420纳米处呈现Soret吸收峰（Wolfe等人，1978；Ramanathan等人，2010）。金枪鱼肌肉的类似结果也已被记录（Smulevich等人，2007）。Suman等人（2006）发表了纯化牛COMb溶液的吸收光谱数据，并得出结论：通过543纳米处吸收值与581纳米处吸收值的比值，可区分COMb与OMb。此外，100% COMb样品在503纳米处还显示出明显的吸收谷。

D. 通过选定波长计算肌红蛋白形态

克日维茨基（1979年）提出了一种替代 K/S 比值法测定肌红蛋白形态的新方法。该方法无需完全转化色素成分，具有显著优势。具体操作时，先测定脱氧肌红蛋白和MMb的含量，

再通过100%总含量减去两者的百分比，间接计算出OMb的含量。该方法基于以下原理：反射衰减(A)是反射率倒数的对数值。反射率在等渗波长474、525和572纳米以及730纳米处测量，其中730纳米的反射率被称为无色素肉的反射率。部分仪器未在730纳米处测量反射率，此时可采用700纳米或更接近730纳米的波长进行测量。根据公式1将反射率(R)转换为反射衰减值(A)，并将A值代入公式2计算MMb，代入公式3计算DMb。氧合血红蛋白的计算采用公式4：