用户文章丨《J. Agric. Food. Chem.》东北林业大学焦骄教授团队发表木豆内生真菌促进其毛状根CSA产量新发现

2024年10月2日，东北林业大学焦骄教授团队在《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》期刊发表了题为“Enhanced Accumulation of Health-Promoting Cajaninstilbene Acid in Pigeon Pea Hairy Root Cultures Cocultured with an Endophytic Fungus during Early Stages of Colonization”的文章。文章通过共培养揭示了木豆内生真菌（Penicillium rubens，P. rubens）促进其毛状根中木豆芪酸（Cajaninstilbene acid, CSA）生物合成与积累的机制。核心产品——S3000超快三维荧光成像系统为P. rubens定殖木豆毛状根过程的可视化提供了快速、直观的检测手段。   

一、研究背景

豆类是全球主要的人类使用粮食作物之一，其中木豆以富含各种营养成分和生物活性化合物受到消费者的高度青睐。在木豆的多种生物活性化合物中，CSA是天然的芪类化合物之一，该化合物在抗氧化、抗菌和抗肿瘤等领域具有良好的开发潜力。然而CSA在木豆中合成和积累受环境、品种、病害的影响会产生很大波动。为解决该问题，该研究团队前期建立了木豆毛状根培养物（PPHRCs）作为稳定生产CSA的可持续替代来源。为使该方法能够实现高效益的生产价值，该研究团队在本文中探索了一种有前景的方法来提高PPHRCs中CSA的积累，以满足营养保健/制药行业对CSA的需求。

二、研究方法

该文章研究团队在前期获取了高CSA产量的木豆毛状根，将其接种于特定培养基中培养42天获得PPHRCs。将健康木豆叶片中分离的一株内生真菌（P. rubens）培养至菌丝状态，收集菌丝。收集到的菌丝一部分用于超高效液相色谱-串联质谱技术（UPLC-MS/MS）检测CSA产量，一部分用于与PPHRCs共培养，观察菌丝与毛状根相互作用过程与CSA产量变化。

三、结果

图1 共培养过程与CSA产量检测

图A为P. rubens真菌与PPHRCs系统共培养示意图；图B为共培养体系表型及共培养体系CSA产量变化

为确定P. rubens不同接种量对PPHRCs的CSA生物合成是否有影响，采用不同接种量进行共培养，结果表明，P. rubens促进PPHRCs的中CSA的生物合成和积累的能力不受剂量效应的影响，以接种剂量为0.5%g/mL最有利于实现CSA高产。

图2 不同P. rubens接种量的培养基颜色变化与CSA产量统计

图A为不同P. rubens接种量的培养体系表型，图B-E为对应不同接种量的同培养条件下的CSA产量统计

由于在上述共培养过程中观察到了典型的防御反应，推测P. rubens在定殖早期引起了毛状根的短暂免疫反应，因此采用显微观察、扫描电镜、棉酚蓝染色以及免疫细胞化学染色观察P. rubens菌丝在木豆毛状根上的定殖过程。结果显示，毛状根的颜色从黄色变为棕色，表面可见丰富的菌丝（图3B红色箭头）；在扫描电镜下（图3CD），P. rubens菌丝附着在毛状根表面，形成明显的附着胞状结构，且表面出现轻微破裂（图3D）。

图3 P. rubens与PPHRCs的显微观察

图AB为42天毛状根单独培养与共培养96 h后的图像；图CD为前述条件下的扫描电镜图片（放大1000倍）；图EF为棉酚蓝染料染色后毛状根单独与共培养体系的显微图片（放大400倍）

在棉酚蓝染料染色后（图3EF）在36 h时观察到大量菌丝；取36 h时的共培养样品进行免疫细胞化学染色（图4），绿色为ConA-FITC染色，蓝色为DAPI染色，红色箭头所指位置为菌丝的分布位置，主要分布在毛状根的细胞间隙或者细胞壁表面，该结果表明共培养的情况下，P. rubens菌丝可以渗透到毛状根组织中，形成稳定的共生关系。

图4 免疫细胞化学染色后毛状根与P. rubens的共定位结果

图A-C为毛状根单独培养的共定位结果，图D-F为毛状根与P. rubens共培养后的共定位结果；红色箭头位置位于毛状根的细胞间隙

四、结论

本文通过将木豆毛状根培养物与内生真菌共培养，发现在共培养的早期阶段，P. rubens的加入促进了木豆毛状根的CSA生成与积累，并在36 h后CSA产量出现了显著下降，可能是由于建立稳定共生关系导致了毛状根组织中CSA分泌的减少，免疫细胞化学染色结果证实了该稳定共生关系的存在。

五、辰英价值

本研究中采用的S3000超快三维荧光成像系统采用了三条纹转盘共聚焦成像技术，配合电动Z轴快速移动扫描，进行有一定厚度的植物根部横切断面快速三维扫描，满足了有一定高度起伏的样品，同时看清多个焦面的需求。得益于S3000超快三维荧光成像系统高达95%QE的面探测器，既提高了成像的灵敏度，也加快了成像速度，为P. rubens和木豆毛状根的相互作用提供了有效的观测工具。

六、研究团队

东北林业大学化学化工与资源利用学院专任教师，主要从事药用植物生物技术、药用植物活性成分生物合成代谢调控及生物转化、药用植物活性成分高值化利用等研究，建立了系列药/食用植物体外细胞/组织/器官及内生真菌培养体系，并利用该生物体系阐明了多种重要功能森林活性成分的次生代谢调控机制，为我国森林植物资源活性成分研究的深层次发展提供了科学思路和积极示范。

东北林业大学化学化工与资源利用学院专任教师，主要从事药用植物生物技术及次生代谢活性产物生物合成调控机制研究，包括药用植物毛状根培养技术、药用植物细胞悬浮培养技术及次生代谢产物生物合成关键调控酶基因筛选等内容。

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