在蛋白纯化的世界里,离子交换层析(IEX)是我们不可或缺的利器。然而,利器也需善用,实验中我们常会遇到纯度不达标、回收率低下、样品过于粘稠等问题,让人头疼不已。
今天,我们就针对这三个高频出现的“拦路虎”,提供一套清晰的排查思路与解决方案,助您的纯化实验一帆风顺。
一
难题一:
纯化后样品纯度不高,杂蛋白去除不理想
策略:调节起始缓冲液pH,使pH更接近目标蛋白的等电点(pI),但远离主要杂蛋白的pI。这样能增强目标蛋白与填料间的静电吸引力,使其被填料捕获,而非直接流穿。
策略:同样先调节起始缓冲液pH,确保目标蛋白能紧密结合。然后,精细优化洗脱条件,采用更平缓的盐梯度或pH梯度,让结合力稍有差异的目标蛋白与杂蛋白能够“分道扬镳”,依次被洗脱下来。
根据目标蛋白和杂蛋白的pI,重新审视所选填料的类型(阴离子交换Q/DEAE,还是阳离子交换SP/CM)和粒径。更小的粒径通常能提供更高的分辨率,但需要更高的操作压力。
二
难题二:
纯化后蛋白收率低下,回收率不达标
收率低通常意味着目标蛋白在纯化过程中有大量损失,可能发生在结合或洗脱步骤。
三
难题三:
样品过于粘稠,上样困难且压力高
粘稠的样品不仅上样慢,还会堵塞填料空隙,导致柱压飙升、分辨率下降。
样品粘稠通常源于高浓度蛋白或高分子量核酸(如基因组DNA)的存在。
从源头稀释:在细胞裂解前,增加用于重悬细胞的缓冲液体积,直接降低样品整体浓度。
降解核酸:
- 延长裂解时间,并确保含有足量的DNase和Mg2?,让其充分降解DNA。
- 提升机械裂解(如超声)的效率,有助于剪切核酸,降低粘度。
调整上样参数:
- 降低上样流速,给予粘稠样品足够的时间通过填料床,避免瞬间压柱。
四
总结
离子交换层析的优化是一个系统工程。当遇到问题时,建议遵循以下流程进行排查:
纯度问题→ 检查结合特异性与洗脱分辨率
收率问题→检查结合效率与洗脱完全度
压力/粘度问题 → 检查样品前处理与上样条件
记住,充分的样品前处理和精细的缓冲液条件优化是成功的一半。希望这份指南能帮助您快速定位问题,让您的下一次离子交换纯化实验获得圆满成功!
关于赛谱仪器
苏州赛谱仪器有限公司(以下简称 “赛谱仪器”)成立于 2011 年,是由世界知名自动化控制及分析仪器专家共同创办,集研发、生产、全球销售与服务于一体的国家高新技术企业。赛谱仪器专注于开发精密纯化、合成及相关设备,产品广泛应用于蛋白、抗体、疫苗、核酸、诊断原料、多肽等大 / 小分子生物制品领域。
2022 年 4 月,赛谱仪器正式成为纳微科技(股票代码:688690.SH)的控股子公司。依托双方资源互补、应用技术共享及跨部门协同,赛谱仪器的自主创新能力得到进一步提升,未来将持续为客户提供更丰富、更完善、更稳定、更贴合实际应用的产品,以及更优质的服务。
关于纳微科技
苏州纳微科技股份有限公司(688690.SH)是一家以“以创新,赢尊重,得未来”为核心经营理念的国家高新技术企业。公司专注于高精度、高性能、高质量微球材料的研发与生产,是全球少数具备多品种、多规格微球产品供应能力的企业之一。
凭借持续的创新驱动,纳微科技致力于打造全球领先的纳米微球精准制备和应用平台,产品涵盖硅胶正相、反相、HILIC、手性填料、固相萃取、聚合物反相、离子交换、疏水层析、亲和层析(Protein A、金属螯合、苯硼酸)、复合模式、凝胶渗透色谱及特殊功能填料;整合旗下纳谱分析(色谱柱与应用)、福立仪器(分析仪器)、赛谱仪器(蛋白纯化系统)等子公司关键资源,成功构建了从色谱填料→色谱柱→分离/分析设备→智能化解决方案的全产业链闭环,打造全球领先的“色谱全生态平台”。
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