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蛋白纯化难题破解:离子交换层析常见问题与优化指南

来源:苏州赛谱仪器有限公司 更新时间:2026-01-21 15:45:29 阅读量:10
导读:在蛋白纯化的世界里,离子交换层析(IEX)是我们不可或缺的利器。然而,利器也需善用,实验中我们常会遇到纯度不达标、回收率低下、样品过于粘稠等问题,让人头疼不已。今天,我们就针对这三个高频


在蛋白纯化的世界里,离子交换层析(IEX)是我们不可或缺的利器。然而,利器也需善用,实验中我们常会遇到纯度不达标、回收率低下、样品过于粘稠等问题,让人头疼不已。

今天,我们就针对这三个高频出现的拦路虎,提供一套清晰的排查思路与解决方案,助您的纯化实验一帆风顺。




难题一:

纯化后样品纯度不高,杂蛋白去除不理想



当跑完IEX后发现目标蛋白纯度未达预期,我们需要从结合、洗脱和操作三个层面逐一排查。

 优化结合条件:精准“吸附”目标蛋白 

情景A:目标蛋白和多数杂蛋白一起穿透(流穿)

策略:调节起始缓冲液pH,使pH更接近目标蛋白的等电点(pI),但远离主要杂蛋白的pI。这样能增强目标蛋白与填料间的静电吸引力,使其被填料捕获,而非直接流穿。


情景B:目标蛋白与杂蛋白一同结合,洗脱时无法分开

策略:同样先调节起始缓冲液pH,确保目标蛋白能紧密结合。然后,精细优化洗脱条件,采用更平缓的盐梯度或pH梯度,让结合力稍有差异的目标蛋白与杂蛋白能够分道扬镳,依次被洗脱下来。


 优化洗脱过程:实现完美“分离” 

  • 降低洗脱流速:过快的流速会导致洗脱峰变宽、重叠,降低分辨率。适当降低流速,给不同蛋白与填料解离留出更充分的时间,峰形会更尖锐,分离效果更好。

  • 确保充分平衡:上样前,必须用至少5 - 10柱体积(CV)的起始缓冲液平衡层析柱,直至基线平稳。不平衡的柱子pH和电导不均,会直接导致结合异常和纯度下降。

  • 调整样品溶液:确保样品液的pH和离子强度与起始缓冲液基本一致。如果样品粘度过高(见难题三),也会影响传质,导致峰形拖尾和纯度降低。


 重新评估填料选择:用对“武器” 

根据目标蛋白和杂蛋白的pI,重新审视所选填料的类型(阴离子交换Q/DEAE,还是阳离子交换SP/CM)和粒径。更小的粒径通常能提供更高的分辨率,但需要更高的操作压力。




难题二:

纯化后蛋白收率低下,回收率不达标



收率低通常意味着目标蛋白在纯化过程中有大量损失,可能发生在结合或洗脱步骤。


 确保有效结合:避免“过门不入” 

核对pH一致性:这是最常见的原因。务必确保样品溶液的pH与起始缓冲液的pH完全一致。任何差异都会导致样品进入层析柱后局部环境改变,影响目标蛋白与填料的结合。


 优化洗脱策略:实现完全“释放” 

  • 尝试阶梯洗脱:如果使用线性梯度洗脱效果不佳,可以尝试阶段性梯度(阶梯洗脱)。在目标蛋白洗脱的盐浓度附近,设置一个平台进行洗脱,这有时能更集中地将目标蛋白洗下,提高回收率。

  • 改变洗脱方法:如果pH洗脱收率低,可以尝试更换为更温和、更通用的盐梯度洗脱。反之亦然。

  • 增强洗脱强度:检查当前的洗脱条件(盐浓度或pH)是否足够强,能否将紧密结合的目标蛋白完全下来。可以尝试一个高强度的清洗步骤(如1M NaCl)来验证是否有残留。




难题三:

样品过于粘稠,上样困难且压力高



粘稠的样品不仅上样慢,还会堵塞填料空隙,导致柱压飙升、分辨率下降。


 原因与解决方案:

样品粘稠通常源于高浓度蛋白或高分子量核酸(如基因组DNA)的存在。

  • 从源头稀释:在细胞裂解前,增加用于重悬细胞的缓冲液体积,直接降低样品整体浓度。


  • 降解核酸:

    - 延长裂解时间,并确保含有足量的DNase和Mg2?,让其充分降解DNA。

    - 提升机械裂解(如超声)的效率,有助于剪切核酸,降低粘度。


  • 调整上样参数:

    - 降低上样流速,给予粘稠样品足够的时间通过填料床,避免瞬间压柱。



总结



离子交换层析的优化是一个系统工程。当遇到问题时,建议遵循以下流程进行排查:

  • 纯度问题→ 检查结合特异性与洗脱分辨率

  • 收率问题→检查结合效率与洗脱完全度

  • 压力/粘度问题 → 检查样品前处理与上样条件

记住,充分的样品前处理和精细的缓冲液条件优化是成功的一半。希望这份指南能帮助您快速定位问题,让您的下一次离子交换纯化实验获得圆满成功!



关于赛谱仪器

苏州赛谱仪器有限公司(以下简称 “赛谱仪器)成立于 2011 年,是由世界知名自动化控制及分析仪器专家共同创办,集研发、生产、全球销售与服务于一体的国家高新技术企业。赛谱仪器专注于开发精密纯化、合成及相关设备,产品广泛应用于蛋白、抗体、疫苗、核酸、诊断原料、多肽等大 / 小分子生物制品领域。

2022  4 月,赛谱仪器正式成为纳微科技(股票代码:688690.SH)的控股子公司。依托双方资源互补、应用技术共享及跨部门协同,赛谱仪器的自主创新能力得到进一步提升,未来将持续为客户提供更丰富、更完善、更稳定、更贴合实际应用的产品,以及更优质的服务。


关于纳微科技

苏州纳微科技股份有限公司(688690.SH)是一家以“以创新,赢尊重,得未来”为核心经营理念的国家高新技术企业。公司专注于高精度、高性能、高质量微球材料的研发与生产,是全球少数具备多品种、多规格微球产品供应能力的企业之一。

凭借持续的创新驱动,纳微科技致力于打造全球领先的纳米微球精准制备和应用平台,产品涵盖硅胶正相、反相、HILIC、手性填料、固相萃取、聚合物反相、离子交换、疏水层析、亲和层析(Protein A、金属螯合、苯硼酸)、复合模式、凝胶渗透色谱及特殊功能填料;整合旗下纳谱分析(色谱柱与应用)、福立仪器(分析仪器)、赛谱仪器(蛋白纯化系统)等子公司关键资源,成功构建了从色谱填料→色谱柱→分离/分析设备→智能化解决方案的全产业链闭环,打造全球领先的“色谱全生态平台”。

了解更多信息,敬请访问www.nanomicro.com

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