毕赤酵母表达人组织因子的优化与纯化工艺研究

摘要

在优化毕赤酵母表达系统生产人组织因子的工艺条件。通过密码子优化、发酵参数调控及纯化策略改进，显著提高了目标蛋白产量与纯度。采用某品牌威尼德电穿孔仪进行高效转化，结合亲和层析与分子筛纯化，最终获得高活性重组人组织因子，为临床应用奠定基础。

引言

人组织因子（human Tissue Factor, hTF）是凝血级联反应的关键起始因子，在止血、血栓性疾病及肿瘤生物学中具有重要作用。重组hTF的生产对于基础研究与临床应用至关重要。毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种高效的真核表达系统，具有蛋白折叠准确、翻译后修饰完善及高密度发酵等优势，已成为重组蛋白生产的理想平台。

然而，hTF在毕赤酵母中的表达仍面临诸多挑战，包括表达量低、蛋白降解及纯化困难等问题。研究系统优化了hTF的密码子、发酵条件及纯化工艺，旨在建立一套高效、稳定的生产流程。通过引入某品牌威尼德电穿孔仪提高转化效率，并采用多步层析策略提升蛋白纯度，为大规模生产高质量hTF提供了可靠方案。

材料与方法

1. 菌株与载体

实验选用毕赤酵母GS115菌株作为表达宿主。hTF基因经密码子优化后克隆至pPIC9K载体，该载体含有AOX1启动子及His6标签序列，便于诱导表达与纯化。

2. 表达载体构建

通过PCR扩增优化后的hTF基因，利用某试剂限制性内切酶进行双酶切，随后连接至线性化pPIC9K载体。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆并测序验证。

3. 毕赤酵母转化

将验证正确的重组质粒线性化后，采用某品牌威尼德电穿孔仪进行毕赤酵母电转化。电穿孔参数设置为：电压1500 V，电容25 μF，电阻200 Ω。转化后的细胞涂布于MD平板（不含组氨酸），30℃培养3-5天。通过G418抗性筛选高拷贝转化子。

4. 表达条件优化

4.1 摇瓶水平筛选

挑取单菌落接种于BMGY培养基，30℃、250 rpm培养至OD600=2-6。离心收集菌体，重悬于BMMY培养基（含0.5%甲醇）诱导表达。每24小时补加甲醇至终浓度0.5%，持续诱导96小时。

4.2 发酵罐水平优化

采用5 L发酵罐进行高密度发酵。发酵分为三个阶段：

甘油批式阶段：初始甘油浓度4%，溶解氧（DO）维持在30%；

甘油补料阶段：控制甘油流加速率，维持DO在20%；

甲醇诱导阶段：梯度增加甲醇浓度（0.5%-2%），DO控制在10%。

定期取样检测菌体密度（OD600）、蛋白表达量及活性。

5. 蛋白纯化

5.1 粗提物制备

发酵液离心收集上清，经0.45 μm滤膜过滤后，用某试剂Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）透析。

5.2 亲和层析

将透析样品上样至Ni-NTA亲和柱，结合缓冲液为20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含300 mM NaCl、10 mM咪唑），洗脱缓冲液含250 mM咪唑。收集洗脱峰，SDS-PAGE检测纯度。

5.3 分子筛层析

进一步采用Superdex 75分子筛柱进行精纯。以PBS（pH 7.4）为流动相，流速0.5 mL/min。收集主峰，测定蛋白浓度与活性。

6. 分析检测

6.1 SDS-PAGE与Western blot

采用12% SDS-PAGE分析蛋白纯度，某试剂考马斯亮蓝染色。Western blot使用抗His标签一抗及HRP标记二抗，某品牌威尼德紫外交联仪进行膜固定。

6.2 蛋白活性测定

通过凝血时间测定评估hTF活性。将纯化蛋白与乏血小板血浆混合，记录纤维蛋白形成时间，以商业hTF为标准对照。

结果

1. 表达载体构建与转化

密码子优化后的hTF基因成功克隆至pPIC9K载体，测序结果显示无突变。某品牌威尼德电穿孔仪转化效率达1×10^5 cfu/μg DNA，显著高于传统化学转化法。

2. 表达条件优化结果

摇瓶水平筛选显示，甲醇诱导72小时时表达量最高（约120 mg/L）。发酵罐优化后，通过控制DO与甲醇梯度，最终产量提升至450 mg/L，较初始条件提高3.75倍。

3. 纯化工艺评价

Ni-NTA亲和层析一步纯化后，蛋白纯度达85%；经分子筛精纯，最终纯度>95%，比活性为1.2×10^5 U/mg。SDS-PAGE与Western blot证实目标蛋白大小正确（约47 kDa），无降解条带。

4. 蛋白活性分析

纯化hTF可显著缩短血浆凝血时间（从180 s降至45 s），活性与商业标准品相当（P>0.05）。

讨论

本研究通过系统优化毕赤酵母表达hTF的全流程，实现了高产高质的目标。密码子优化解决了异源表达效率低的问题；某品牌威尼德电穿孔仪的应用大幅提升了转化效率；而发酵参数的精细调控（如DO与甲醇梯度）则有效平衡了菌体生长与蛋白表达。

在纯化工艺中，Ni-NTA亲和层析结合分子筛的策略兼顾效率与成本，避免了传统离子交换层析的复杂操作。值得注意的是，hTF的凝血活性高度依赖其正确折叠，毕赤酵母的真核分泌系统为此提供了保障。

结论

研究建立了一套高效的毕赤酵母表达与纯化hTF的工艺。通过密码子优化、发酵参数调控及多步层析，实现了高产（450 mg/L）、高纯（>95%）与高活性（1.2×10^5 U/mg）的重组hTF制备。该工艺稳定可靠，为临床级hTF的生产奠定了技术基础。

参考文献

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