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分子克隆常用技术
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分子克隆常用技术
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2024-09-28 00:37
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2018-07-18 14:29
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2018-07-23 15:45
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常用蛋白电泳检测技术与检测项目
- 常用蛋白电泳检测技术与检测项目血清蛋白电泳新鲜血清经电泳后可极ng确地描绘出患者蛋白质的全貌,有助于许多临床疾病判断的参考,在各类教材书上已清晰的描述了各种病理现象所显现的图像,一般常见的是白蛋白降低,某个球蛋白区域升高,提示不同的临床意义。如球蛋白多克隆(poly-clonal),β-γ融合的桥连现象,在γ区呈现细而密的寡克隆(oligoclonal)区带,及由单一克隆浆细胞异常增殖所产生的单克隆(monoclonal)免疫球蛋白区带,又称M蛋白(MonoclonalProtein)带,血清蛋白电泳是其的实验诊断方法。血清蛋白电泳目前Z常用的检查方法是醋酸纤维膜电泳法。免疫固定电泳血清免疫固定电泳(Immunofixation,IF)技术是血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经电泳分离后,应用蛋白质固定剂和各型免疫球蛋白及其轻链抗血清,加于凝胶表面的泳道上,经孵育和扩散后,若有对应的抗原存在,则在适应位置形成抗原抗体复合物并沉淀下来。染色后蛋白质电泳参考泳道和抗原抗体沉淀区带被氨基黑着色,根据电泳移动距离分离出单克隆组份,可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。血清免疫固定电泳技术用于M蛋白的型、亚型和轻链型,本周(Bence-Jonse)蛋白和游离轻链的分型和鉴别。同工酶电泳血清乳酸脱氢酶同工酶电泳血清肌酸激酶及其亚型同工酶电泳血清碱性磷酸酶同工酶电泳血清碱性磷酸酶同工酶电泳具有三种不同结构的基因编码或在转移后修饰的结果,按其氨基酸序列可分为小肠型、胎盘型和组织非特异型(肝、肾、骨),它们各自表达产物可在血清中呈现,具有不同的意义。利用麦胚凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)与ALP-L1和ALP-B糖链亲和力的不同,血清与WGA作用再经电泳后可将ALP同工酶予以分离。肝外胆道阻塞转移肝癌时,高分子ALP(ALP-L2)明显,在原发性肝癌时肝型ALP(ALP-L1)明显,骨转移性癌时ALP-B。脂蛋白电泳应用自动电泳系统可将血清中脂蛋白组份进行分离,呈现LDL、VLDL和HDL条带,输入TC值,计算各种脂蛋白中胆固醇含量,LDL-C/HDL-C比值在正常人群组与冠心病患者组存在显著差异(p<0.001);诊断临界值(cut-offpoint)为3.89,诊断灵敏度76.7%,特异性79.8%。LDL-C/HDL-C比值是粥样硬化性冠脉疾病重要的危险因子之一,明显优于胆固醇或其它血脂的单个含量指标,且随比值的增加,患冠脉疾病的危险性相应增大。在凝胶中脂蛋白的等电点不同,不仅可区分α,前β和β区带,又因介质中含有抗LP(a)抗体及阳离子存在,抗LP(a)抗体与患者血清中LP(a)结合形成复合物,阳离子则YZ其它脂蛋白的泳动速度,LP(a)便与其它脂蛋白分离开来。清晰的LP(a)条带呈现在前β与γ区域之间,阳性条带扫描后,可获得区带的面积及其百分含量,提高了对心、脑血管独立的危险因子LP(a)检测的敏感性和特异性。血红蛋白电泳血红蛋白电泳可使正常血红蛋白HbA与HbA2分离,也可检测出大部分异常血红蛋白如:HbS、HbD、HbC和HbE。当HbA2、HbC和HbE>20%时,则难以分离和鉴别。应先用碱性琼脂糖凝胶血红蛋白电泳进行正常和异常血红蛋白的分离和检测,通常用于孕妇的筛选,然后再进行酸性琼脂糖凝胶血红蛋白电泳,对异常血红蛋白予以分离和鉴别。血红蛋白遗传性分子病常分为异常Hb病和地中海贫血两大类。异常Hb病如镰状细胞贫血,在碱性缓冲液中异常HbS电泳区带的位置呈现在HbA与HbA2之间,异常血红蛋白的HbC和HbE电泳迁移率都十分缓慢,HbC和HbA2可重叠。在PH6.2的枸橼酸缓冲液的是琼脂糖介质电泳中,由于HbC不能与HbA分离,这样就可检测出HbE。异常血红蛋白HbD是在碱性缓冲液中其电泳迁移率如同HbS,而在PH6.2枸橼酸缓冲液的琼脂糖介质中,因HbS与HbA不能分离,这样就可以分离和检测出HbD。β-地中海贫血是HbA的合成受损,电泳图谱可呈现HbA2与HbF区带。糖化血红蛋白电泳非浓缩尿蛋白电泳脑脊液电泳血清蛋白电泳正常参考值:白蛋白:0.55~0.69球蛋白α1:0.03~0.08球蛋白α2:0.04~0.09球蛋白β:0.10~0.18球蛋白γ:0.04~0.13脑脊液蛋白电泳主要用于多发性硬化症,神经梅毒及亚急性硬化性全脑炎等的诊断。血清蛋白电泳的临床意义白蛋白:椎管阻塞,脑水肿,缺氧性脑病,格林-巴利综合征,结缔组织疾病等。球蛋白:神经梅毒,脑炎,多发性硬化症等。在肝细胞受损时,血清白蛋白、α1球蛋白和α2球蛋白减少,同时受损赶下包作为自身抗原刺激淋巴系统,使λ球蛋白增加,知识肝病患者血清蛋白电泳的共同特征。轻症急性肝炎时电泳结果多无异常,病情加重后白蛋白,α和β球蛋白减少,γ球蛋白增加。球蛋白增加的程度与肝炎的严重程度相关,如持续提示肝炎转化为慢性。肝硬化时候白蛋白中毒或者高度减少,α1,α2和β球蛋白也有降低倾向,γ球蛋白明显增加。肝细胞肝癌常与肝硬化并存在,故蛋白电泳图像和肝硬化相似,但常有α球蛋白升高,偶可见甲胎蛋白带的出现。临床电泳临床中何时需要病人的电泳结果?1.怀疑有多发性瘤病;2.不明的外周神经病(糖尿病、毒素照射、化疗除外);3.根据其它实验室的数据,需要做蛋白电泳3.1总蛋白异常或白蛋白异常3.2尿蛋白升高3.3由于恶变而引起的血钙过多(如临床相关的症状为失重,疲劳,骨痛,异常出血)3.4WBC、RBC升高4.临床上出现如下症状时炎症疾病、自身免疫性疾病、肾病、肝病、蛋白质丢失的相关疾病临床蛋白电泳的地位1.用于初筛,对疾病进行Z初的评估;2.避免漏诊;3.方法学稳定。相关产品优质试剂质量放心价格Zdi为ZG生物产业做贡献上海索来宝特价促销联系021-54100800手机18018609966[详细]
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2018-09-02 10:00
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2014-09-05 00:00
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BT产品应用(22)使用QPix400系统自动筛选颜色克隆:如红白克隆筛选
- 通过颜色来筛选重组细菌是一个简单且GX的方法。比如常用的蓝白克隆筛选,通过B-半乳糖苷酶和X-gal之间的反应,通过颜色的变化区分克隆是否成功插入外源基因。我们QPix400系统通过使用QPix颜色克隆筛选软件模块和红色QPix颜色滤光片成功实现自动化的蓝白克隆筛选,大大增加实验室重组克隆的筛选效率。通过功能扩展,现在QPix400系统通过QPix颜色克隆筛选软件模块和新的蓝色QPix滤光片(Figure1)可以实现红白克隆的筛选。可以应用于筛选天然红色的微生物克隆如酒红色酵母以及和X-gal反应变成红色的克隆。本文描述了如何使用QPix400系统进行红白克隆的筛选。[详细]
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2024-09-11 17:48
应用文章
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免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物
- 免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物(一)辣根过氧化物酶在免疫酶技术中,辣根过氧化物酶(HRP)是Z理想、应用Z多的标记酶,是从一种称为辣根的植物根部分离、纯化获得。HRP分子中含有含铁血红素基团(高铁血红素),是HRP的活性基团,在溶液中呈棕黄色,HRP中的高铁血红素与H202形成一种复合物,然后脱水,氧原子形成。几种底物可使HRP氧化,Z常用的有二种,即多酚和硝基盐。HRP的优点有以下几个方面。(1)体积小(分子质量40kDa),不会遮盖抗原的结合部位,且穿透力强,易与细胞内抗原结合。(2)稳定且易获得高纯度酶制品。(3)具有较高活性及特异性。(4)不溶性好,终产物不向周边扩散。(5)组织中内源性酶较少,YZ方法较多。(6)价格相对较便宜。(7)特异性底物是过氧化氢(H202),可选用不同电子供体(发色基团),使终产物呈不同颜色。例如3,3’二氨基联苯胺(DAB)为棕褐色,3氨基9乙基卡巴唑(AEC)为红色,4氯1苯酚(CN)为蓝色。AEC室温下较稳定,产物不溶于水,但溶于有机溶剂,所以不能进行脱水等处理;又因其需用水溶性封固剂,时间长易褪色,限制了其应用。DAB是广泛应用的电子供体,产物既不溶于水,又不溶于有机溶液,可长期保存。其终产物具有嗜锇性,经锇酸处理后电子密度增加,适用于电镜下观察。但DAB的缺点是具有潜在的致癌性,所以应尽量减少吸人和接触次数,并严格管理废液。尽管有人反对应用DAB,但目前还未找到一种比它更好的替代品,所以应用依然Z为广泛。HRP与底物H202呈色反应原理见图4l。HRP的特异底物为H202,在分解Hz02过程中,与H202形成初级复合物,无电子供体时,反应不再继续进行,当电子供体存在时,反应以一定的速度形成第二种复合物。HRP催化H202已形成的中间型产物,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化、聚合,再经氧化环化?Z后形成吲哚胺多聚体,此多聚体进一步氧化、环化,形成苯乙肼聚合体,如供氢体是DAB,产物为棕褐色;如是AEC,产物为红色。(二)碱性磷酸酶目前商品化的AKP均来源于牛小肠,称为牛肠碱性磷酸酶(calfintestinalkalinephosphatase),其分子质量为100kDa,故而穿透细胞组织的能力较弱。某些组织细胞内含有较高的内源性碱性和酸性磷酸酶,例如人体和鼠类、狗等动物组织的肝、肾、肠,对IHC染色会产生一定的干扰,因此限制了它的应用。AKP主要用于血涂片或涂片的白细胞抗原检测。但是由于AKP的呈色反应的敏感性要比HRP高23倍,显色时间可从30min到48h,可与HRP组合进行IHC的双重或多重标记。另外,内源性碱性磷酸酶可以在底物缓冲液中加入左旋咪唑(1evamisole)和镁离子(氯化镁),或提高底物缓冲液的pH值,可以有效地消除内源性碱性磷酸酶,使该酶应用比例日趋增多。目前该酶已广泛应用于原位杂交检测的显色和双重酶标染色。(三)葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(glucoseoxdase,GOD)以葡萄糖为底物,生成蓝色不溶性沉淀。该终产物较稳定,不溶于有机溶剂,故易保存,但因其分子质量为150kDa,不能穿人细胞,影响了其应用。另外,该酶的敏感性较低,主要是酶与底物反应敏感性低。目前主要用于IHC的多重标记。免疫酶组织化学技术的常用酶及其底物[详细]
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2018-09-14 10:01
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巨噬细胞克隆刺激因子 M-CSF单抗
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2024-09-17 04:42
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