整体胚胎样品的自动化原位杂交实验方案（WMISH）

介绍

原位杂交，即对RNA的检测，是一项用于描绘生物体内基因时空表达谱的强大技术。它主要应用于发育生物学，但在遗传学、进化发育生物学、癌症研究和成体干细胞等领域越来越重要。

原位杂交实验方案要求将样品与多种试剂和缓冲液精确孵育特定时间，因此该实验繁琐耗时，需要数天进行费力地重复清洗和孵育步骤。自动化原位杂交和免疫组织化学方案不仅能提高结果可重复性，而且能提高通量。

此外，对于手动操作原位杂交实验流程需要许多仪器，如不同型号的样品瓶与深孔板、特定温度（室温、冷藏室和37℃）的振荡器、杂交和预杂交后洗涤所用的培养箱、预热溶液的水浴锅等。这些设备在全自动实验方案中可以被省去。这里我们展示了对于整体胚胎样品的自动化原位杂交实验方案可用于多种不同的模式生物，如小鼠、鸡、非洲爪蟾、斑马鱼和拟南芥。

材料和方法

IntisuPro 系列包括InsituPro VSi，前身IsituPro VS 和升级版的InsituPro （Plickert et al. 1997），它们都具有相同的操作原理：整体样品在孵育篮中同时并行处理，实现温和可靠的液体交换。这三款仪器都基于Gilson XYZ 移液机器人和Gilson 402 稀释仪。稀释仪通过独特的不锈钢二元注射针驱动液体交换。数个可加热或冷却的缓冲液储存点，使其能自动化完成复杂的实验方案。控温架用于加热和冷却样品支架，如用在InsituPro VSi中最 多容纳60个直径13mm孵育篮的支架。

图1：InsituPro VSi 的工作区域和样品架

开盖的InsituPro VSi 的工作区域（A），中号篮的样品架（B）

在用InsituPro系列产品处理样品时，将样品放入底部带有网孔的封闭的孵育篮中。然后将篮子放在钥匙孔状的空腔内，作为单独的孵育室。3种不同尺寸的孵育篮可用于不同大小的胚胎样品。有机玻璃盖和硅树脂密封膜将密封整个装置，以保持运行过程中的温度和湿度。带有钥匙孔状空腔的平板被叫做“样品架”，放置在温控板的顶部，可在原位检测中加热或者冷却。

为了移除和添加试剂，系统配备了独特的双元移液针。该针连接两个传输管，分别作为移除废液和添加新缓冲液的通道。在一个液体交换循环内，InsituPro VSi/ InsituPro VS/ InsituPro UP 吸入废液到废液通道中（图2A）。新缓冲液通过第二个“新缓冲液”通道立即被加入。交换液体所需时间，即样品未被缓冲液覆盖的时间，低于一秒。在这短暂的时间内，孵育腔充当潮湿室，保持脆弱的样品湿润。整个液体处理过程经过优化，即使是最 精细的样品也能使用单独的探针或者抗体进行全自动处理。此外，仪器允许回收珍贵的探针和溶液。大量的洗涤操作可以避免交叉污染。双元移液针组成示意图如图所示（图3）。

图2：移液机双元通道

用过的缓冲液被吸入废液通道（A），样品在潮湿环境中等待新缓（B），新缓冲液用第二通道加入（C）

图3：双元移液针

双元移液针提供了新溶液和旧溶液最 大限度的分离。通过外针移除旧缓冲液；新试剂通过内针输送。针头的特氟龙涂层可以确保在吸入和分配腐蚀性溶液时不会被腐蚀。大量的洗涤步骤可以防止交叉污染。

InsituPro系列仪器能被用于自动化完成原位杂交中的所有重要步骤，从样品预杂交到用于信号检测抗体的最 后孵育。

杂交前处理

储存在酒精中样品首先通过一系列逐级的甲醇或乙醇复水。一些有色样品（特定时期的小鼠或鸡胚胎）必须通过与过氧化氢孵育漂白，这同时也使内部过氧化物酶失活。为了让探针和抗体能接触到样品组织，用蛋白酶处理样品（如蛋白酶K），对羟苯甘氨酸通常用于立即停止蛋白酶K的反应。可选的，用混合洗涤剂进行渗透。为了部分水解植物样品的细胞壁，可用盐酸或者崩溃酶、纤维素酶等酶进行处理。渗透后，大多数样品需要多聚甲醛进行固定步骤。

杂交

杂交前，预杂交步骤能逐渐改变杂交缓冲液，并封闭非特异性结合位点。与RNA探针的试剂杂交通常发生在50-70℃。在特定温度进行多次杂交后洗涤，以去除未结合或者非特异结合的RNA探针。RNA酶消化同样能被用于去除未结合探针来减少背景问题。

抗体介导的信号检测

为了减少非特异背景，使用封闭试剂（如罗氏封闭试剂、BSA、山羊或绵羊血清）进行孵育步骤，来饱和非特异结合位点。随后，将样品与与 RNA 探针的特异性半抗原标记（例如地黄毒苷 DIG 或异硫氰酸荧光素 FITC）结合的抗体一起孵育。抗体通常与用于比色检测的酶（如碱性磷酸酶 AP 或辣根过氧化物酶 HP）或用于荧光检测的荧光团（如 Alexa Fluor 488）连接。抗体可以在与样品孵育后回收。需要回收时，抗体瓶可以放置在可冷却的位置（4-8℃），并且孵育也可以在较低的温度下进行。未结合的抗体可以通过数个步骤移除。如使用AP比色法检测，样品如果使用 AP 比色检测，则将样品与碱性缓冲液一起孵育以进行酶促显色反应。可以在 InsituPro VSi 外部进行与底物的孵育以观察染色反应，也可以将其编程到仪器内部的特定时间。额外的信号放大步骤（例如酪胺信号放大系统）可用于改善弱表达基因的检测。

图4：自动化原位杂交可用于多种生物

自动化原位杂交实验方案已用于黑腹果蝇幼虫 (A)、青鳉 (Oryzias latipes, B)、寻常水螅 (C)、小鼠 (Mus musculus, D 和 F)、Ciona gutis (E)、拟南芥 (G)、鸡 (Gallus gallus, H)、斑马鱼 (Danio rerio) (I)、非洲爪蟾 (J)、涡虫 (Schmittea mediteranea) (K) 和活组织检查 (小鼠肾上腺, L)

结果

InsituPro 系列以及成功用于多种生物的多种生物的原位杂交实验方案（图4），例如拟南芥(Hejatko等人2006)、鸡(Gallus gallus)(Olivera-Martinez和Storey 2007)、Ciona gutis、Drosophila melanogaster (Behr等人2003)、Oryzias latipes (Quiring等人2004)、Hydra vulgaris、mouse (Mus musculus)(Filinaux et al. 2008, Thomsen et al. 2008), Schmidtea mediteranea (Pearson et al. 2009), 非洲爪蟾(Pollet et al. 2005)和斑马鱼(Danio rerio) (Reischauer et al. 2009)。一般来说，染色的结果与人工实验中的染色相当。然而，对于某些组织，组织学实验结果可以通过使用 InsituPro 系列仪器来改善（图 5）。

图5：类似的染色结果，但使用InsituPro系列仪器进一步保存样品形态

使用 Sonic Hedgehog (shh) 探针对鸡肢芽进行的原位杂交方案的比较表明，与手动处理 (B) 相比，使用 InsituPro 线仪器 (A) 时顶端外胚层脊 (黄色箭头) 的形态保存更好。

讨论

我们展示了 InsituPro 系列仪器可用于多种全胚胎和活检样本的自动原位杂交（图 4）。自动化得到与手动处理相当的染色，但可以改善形态保存（图 5）。因此，它可以用于所有测试样品的标准实验室实验。此外，它还可用于高通量筛选(Quiring et al. 2004)，因为它提高了实验的通量和可重复性。