可见！！！ 变化着的分子结构 冷冻电子显微镜揭开生命的奥秘

可见！！！ 变化着的分子结构   冷冻电子显微镜揭开生命的奥秘

访大阪大学大学院生命机能研究科  難波 啓一教授

蛋白质是构成生物体、参与思考和行为活动的基础。 大阪大学的難波 啓一教授被蛋白质的优异机制深深地吸引，不断尝试着从立体结构来揭开它神秘的面纱。

从结构理解功能

人体中约有10万种蛋白质，它们有的生成身体组织，有的作为酶负责代谢，有的在细胞膜上运载营养物质，每一种都有着自己的职责，简直可以说就是生命活动的本身。

“蛋白质说起来就象是在体内工作的‘纳米机器’，这么小的‘机器’起什么样的作用，又是怎样运动的，我对此无比感兴趣。”说这番话的是大阪大学生命机能研究科质子纳米机械实验室的難波教授，从蛋白质的结构来探求它的功能，難波教授的研究已经持续了四十多年。

蛋白质是由几百至几千个氨基酸连接而成的聚合物。除了部分特殊的东西以外，作为原料的氨基酸只有20种，它们以某些方式结合，形成了10万多种蛋白质。说到几千个连在一起的东西，可能会想象它的形状象链条一样，从连成串这点来看，蛋白质确实和链条相同，但它与链条的决定性差异是每个蛋白质都有自己的三维结构，长长的氨基酸链条复杂地折叠着，如果是相同的蛋白质，它们会在完全相同的位置弯曲，并且角度也一样，但是折叠的方式有时也会有变化，引人兴趣的是，即使分子结构相同但只要三维结构不同，它们就会有完全不同的性质。例如，21世纪初发生的曾让食品行业一度陷入恐慌的疯牛病（BSE）事件，据说原因既不是病毒也不是药物，而是一种被称为朊病毒的蛋白质，令人惊讶的是这种朊病毒本来就存在于人和牛的大脑中，它与造成BSE的异常朊病毒只是部分的三维结构不同而已。换句话说，要了解蛋白质的功能，不仅要通过分析装置知道它的分子结构，还必须设法观察它的三维结构。

精密的生物分子马达

難波教授很早就着眼于生物分子三维结构的研究，并对其中的一群被称为分子马达的蛋白质Z感兴趣，由于它们象马达一样做旋转运动或直线运动，因此被冠以这样一个名字。肌动蛋白和肌球蛋白这样的蛋白质结合形成了人体肌肉的肌原纤维，通过直线运动又引起肌肉收缩。更具有马达特征的大概要数分子马达，它能驱动细菌的象细长尾巴一样的鞭毛，大肠杆菌和沙门氏菌都有几根鞭毛，移动的时候，会将它们捆成一束，然后使它们象螺钉一样旋转以获得推进力。然而，这样的结构长期以来一直未被人所知。

難波教授对这奇异的现象非常着迷，他坚持不懈地对三维结构进行着反复的研究。鞭毛马达就像“马达”这个名字一样，是由环、轴承、转子等30种由蛋白质“制造”的部件组合而成的，结构与一般的电动马达非常相似，肌纤维由超精密、庞大重复的肌动蛋白纤维和肌球蛋白纤维结构形成，因此说马达是人类Z伟大的发明之一，是很傲慢的说法。

要作为马达进行运动，就必须从某个地方获得能量。虽然已经知道鞭毛马达是通过穿越细胞膜的定子通道的氢离子流、肌纤维是通过肌动蛋白的ATP水解来获得能量，但这些都无法解释能量效率为何如此之高。也有观点认为利用的能量源于热波动的布朗运动，但对其中的机制并不清楚。热源是原子和分子波动的能量，如果能将物体放大到原子级别，也许可以观察到以随机的方向和速度进行运动的原子或分子。

通过分子和原子的随机热运动，分子马达肯定不可能产生一个方向的推动力。可实际却是朝着一个方向运动，这就意味着似乎有一种纠正不规则运动的机制。

Z近，難波教授的研究更进一步地接近了真相，他发现了肌纤维的肌球蛋白仅在一个方向上很容易脱落，而在另外不易脱落的方向上存在着类似棘轮的结构，蛋白质分子在改变三维结构的同时，又制造了这个巧妙的动力系统。

被称作“冷冻”的前沿

能有以上这些发现是因为能看到蛋白质的三维结构。在这很长一段时间里，主要是利用被称为X射线晶体结构分析的方法进行观察的：使蛋白质结晶，再照射X射线并测定其衍射反射强度。这是自1950年代以来一直使用的方法，判明蛋白质的三维结构，90％是基于该方法。

但它有个很大的缺点，这是因为它的前提是要结晶，而要使蛋白质结晶，这本身又是件很困难的事情，此外，使蛋白质结晶还意味着要将它固定成Z稳定的三维结构。当分子马达发挥功能时，结构会发生很大的变化，而结晶只有在稳定的形式下才能形成，也就是说，变化着的三维结构是看不到的。

在这种情况下，人们将目光投向了低温冷冻电子显微镜。这种电镜拥有冷冻样品台（称作Cryo stage），能在-160至―270度的极低温度下直接观察冷冻样品，一个一个的蛋白质分子被液体乙烷瞬间冷冻起来的，在“活着”的状态下被密闭在冰中，并被制作成样品。通过低温冷冻电镜观察来自各个方向的投影图像，就可以立体地捕捉到蛋白质在工作瞬间的结构。由于只是冷冻，因此不需要寻找结晶条件。

難波教授20多年以前就开始关注低温冷冻电镜，一直在研究着分析的方法，使用低温冷冻电镜，不仅弄清了肌纤维的肌动蛋白的作用机制，还观察到了鞭毛马达详细的三维结构，实现了教授多年的夙愿。

“象蛋白质这么小的东西，为什么它的工作能变成肉眼可以看得见的肌肉运动？我就是带着这些疑问开始了研究，现在我觉得自己能回答学生时代时一半的问题了。”

瞄准世界**

长期以来，冷冻电镜技术一直落后于在X射线的结构分析，究其原因是因为没有达到足够的分辨率。电子显微镜利用强电子束照射样品，然后接受透射过样品的电子束并根据阴影绘出样品的形状。可是当样品被强电子束照射时，生物分子的结构会受到损伤，因此只能缩小电子束的输出，这就象用小灯泡去照黑房间只能看个模糊的道理一样。

但这一难题在多年的技术开发中正逐步得以解决，在硬件方面，相机取得了长足的进步。 CCD相机是先将电子束转换成光后再接收，在这个过程中由于噪声增大，检测性能无法提高。然而，当出现了可以直接接收电子束的CMOS相机后，不仅灵敏度和分辨率提高了，而且通过高帧率拍摄还能校正图像的模糊，使图像质量有了质的飞跃。在软件方面，图像处理软件的进步也非常显著，软件系统可以从各个方向拍摄的数十万张蛋白质的图像中，找出相同的方向的投影像，对准位置和方向并叠加在一起后，使图像变得更清晰。随着计算机的处理速度的提高，这样复杂的信息处理已经可以在实验室层面进行。

这次難波教授实验室引进的CRYO ARM™，就是日本电子公司应難波教授的“世界**”的要请而开发的，设计的目标是结构分析结果超过2.0Å（1Å为0.1nm），超越标准X射线晶体分析的分辨率，还可以安装多个样品并能自动进行更换，提高易用性等。图像的收集和分析时间也大大缩短了，5年、6年前需要花费1年才能完成的分析，现在只需一周的时间就可以完成。

下图左为難波研究室引进的日本电子制造的低温冷冻电子显微镜 CRYO ARMTM，右图为在别的房间操作低温冷冻电镜的加藤助教和难波教授

即将到来的突破

“再有五年的时间，我们将不仅可以看到蛋白质、还可能看到包括脂质和核酸等在内的所有生物分子复合物的三维结构。”从難波教授的话中可以感受到他的期待。

面向应用，Z令人期待的是对细胞表面的膜蛋白质结构的分析。膜蛋白质是药物分子作用于身体时的靶点，从结构进行分析可以弄清其作用机制，能使治LX果得到飞跃性的提高，还可以制造没有副作用的药物。

将来也可能出现生物分子马达的产业化应用，─种不需要电源、用周围热量作为主要能源就可以工作的超节能机械，将会颠覆人类有史以来对于机器的认知。

[路漫漫其修远兮，吾将上下而求索]。 虽然离成功的路还很长，但希望的曙光就在眼前。

人物简介

難波 啓一（Namba Keiichi） 

大阪大学大学院生命机能研究科教授

大阪大学研究生院基础工学研究科博士后，历任日本学术振兴会奖励研究员、美国的大学的博士研究员、新技术事业团（现科学技术振兴机构）课题组负责人，1992年开始担任松下电器产业株式会社国际研究所主任。2002年开始~至今，大阪大学大学院生命功能研究科教授、分子马达等生体超分子结构和功能解析专业。生物物理学。