小罗开讲 | 下一代测序技术在肿瘤类器官中的应用

类器官（Organoids）是指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养，形成具有一定空间结构的组织类似物^[7]。虽然类器官并不是真正意义上的人体器官，但在结构和功能上能够模拟真实器官，最大程度地还原体内组织的结构，并重现该器官的生理功能，且能够长期稳定地进行传代培养。

图1：类器官作为传统二维培养和动物模型之间的桥梁

图片来源：罗氏诊断整理

患者来源的类器官(Patient-derived organoid，PDO)是成体干细胞来源的类器官的一种。PDO能够保留肿瘤组织的生物学特征和异质性，具有多次传代后基因组保持稳定、培养周期短等优势，因此被认为是肿瘤研究的理想模型。通过将肿瘤组织中的细胞培养成PDO，研究人员可以模拟患者体内的肿瘤环境，并研究肿瘤的发展过程、治疗敏感性以及抗药性。此外，通过PDO还可以进行个性化医学的研究，即根据患者的特定情况和疾病类型，定制特定的治疗方案，以实现个体化治疗的目标^[8]。

目前，类器官技术在疾病建模、毒性测试、药物筛选与评价以及癌症精准治疗等领域得到了广泛应用。而其与下一代测序技术（Next Generation Sequencing, NGS）的结合则为实现精准医疗提供了重要的技术路线。类器官的构建可以为临床前机体对特定药物的反应评估建立有效的离体模型，从而为肿瘤患者制定个性化医疗策略提供基础。对于不同PDO的现有生物库（例如乳腺癌类器官生物库^[9]、膀胱癌类器官生物库^[10]、卵巢癌类器官^[11]、生物库胶质母细胞瘤类器官生物库^[12]等），全基因组测序（WGS）、外显子测序（WES）及转录组测序（RNA-Seq）可用于验证类器官的基因表达谱是否与亲本肿瘤高度相似，以及能否保留肿瘤内和肿瘤间的异质性。多种测序技术的结合使用，也可以为人源PDO模型的多组学分析有效提高靶点发现和验证效率。下图展示了二代测序和类器官培养相结合用于肿瘤个体化治疗的临床前验证路径示例^[13]。

图2：个性化医学策略：利用类器官培养和WES基因分型来应对胰胆癌

图片来源：罗氏诊断整理

对于进行药物筛选前构建培养好的类器官，除了需要从形态学和组织病理学进行评估，分子遗传学的评估和验证也至关重要。WES技术常被应用于对类器官的筛选进行分子遗传学上的质控与鉴定，进而为个性化药物筛选和发现提供临床前工具。2021年，日本研究团队使用外显子组测序和原发性PDO培养相结合的思路，构建了针对胰胆癌基因型的个性化医疗策略^[13]。对6种胆道和胆囊原发性癌症进行了WES测序，大部分类器官表现出了与原发肿瘤相似的组织病理学特征和基因组上的体细胞突变，其中一些突变确定了可能适用于靶向治疗的候选标志物，并证实抑制其中的候选靶标ILK可以抑制来自患者的类器官增殖。在2021年的另一项膀胱癌患者来源类器官的研究中^[14]，作者使用WES分析来鉴定膀胱癌类器官（Patient-derived bladder cancer organoids, BCOs）是否重现了其来源的原发肿瘤的突变谱，结果显示，这些BCOs与其来源的原发肿瘤高度兼容。WES的结果为BCOs用于CAR-T细胞体外临床前测试提供了分子遗传学的评估与验证。2022年，科学家用类器官系统促进抗结直肠癌治疗疗效的预测，并且作为模型进行药物筛选来确定下一步的治疗方案^[15]。这项研究使用WES方法对54位患者的PDO以及相匹配的肿瘤组织进行了突变分析比较，确保了培养的类器官与患者肿瘤组织中的突变特征高度相似，并根据WES数据筛选出潜在的抗癌药物治疗靶点，进而促进了PDO模拟患者药物治疗反应以用作联合临床模型。

肿瘤类器官具有高通量、高效率的特性，在短时间内可获得多种药物的敏感性检测结果。WES在多项PDO的研究中，为类器官分子遗传学的评估和验证提供了有效证据，在其与原发肿瘤相似的组织病理学特征的基础上，同时验证其一致的分子遗传特征，为癌症患者的个性化医疗策略提供了先进的离体模型。

对于任何使用 PDO 的研究来说，一个重要的问题是将观察结果与临床结果联系起来。RNA-seq可以应用于基因表达谱随培养过程的变化、类器官分化过程的监测，以及靶点表达量的分析等方向，为临床信息和表型检测数据建立关联，为高通量靶点或药物筛选提供证据。2021年4月，瑞士肠癌研究所的Joerg Huelsken团队在Cell Reports杂志发表了基于类器官和RNA-seq的靶向类器官测序筛选系统TORNADO-seq^[16]，可检测细胞混合物及其在肠道系统中的分化状态，用于鉴定能够诱导肠道正常细胞和癌细胞分化的小分子药物，为结直肠癌的药物筛选提供了高效的方法。2022年6月，美国学者从高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者中收集了恶性积液标本培养PDO^[17]，并在短期培养期间的两个时间点进行 RNA 测序，以确定转录组随培养过程的变化。基于RNA-Seq的结果，发现短期PDO培养可用于研究个体肿瘤的药物敏感性，药敏测试最终筛选出了4种具有治疗潜力的药物。

RNA-Seq分析也常被用于判断类器官中是否保留了原有的基因表达谱，以判断类器官体外的生长条件或选择有效的培养方法。例如，结肠细胞的类器官培养方法主要有两种类型，但不同培养方法的基因表达模式之间存在着相似与差异^[18]。使用RNA-Seq对结直肠癌类器官系统进行评价，发现其中条件培养基中的肿瘤类器官细胞表现出干细胞标志物OLFM4的高表达和分化标志物CA2的低表达，而正常组织类器官细胞表现相反，这与体内相应的表达量相似。然而，在另一种化学成分培养基中培养的肿瘤类器官和正常组织类器官细胞却具有相似的CA2和OLFM4表达模式，不能准确模拟体内相应细胞的表达模式。在非小细胞肺癌（NSCLC）类器官的研究中^[19]，科学家使用了肺腺癌（LUAD）和肺鳞状细胞癌（LUSC）原发患者的基因表达谱获得的基因列表来确定患者肿瘤和类器官之间的总体基因表达相关性，RNA-Seq分析结果表明NSCLC 类器官和亲本肿瘤之间的基因表达谱相似，验证了使用的体外生长条件允许类器官肿瘤细胞在很大程度上保持其亲代肿瘤的关键分子特性。

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