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你的AAV病毒载体合格了吗?
发布:贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司浏览次数:3619重组腺相关病毒(rAAV)上游生产与下游纯化过程的优化取决于病毒颗粒关键质量属性的表征。生产后AAV的病毒效价、衣壳含量、空壳率、聚集状态等都会影响基因治疗产品的效力、纯度和安全性。所以快速、准确的AAV分析表征,可增强产品质量的理解,并优化生产参数。
为了更全面表征AAV病毒载体,qPCR、ELISA、TEM等都是常用的分析方法。与此同时,分析型超速离心技术(SV-AUC)也已成为确定最佳生产和纯化工艺及监测rAAV载体属性以确保其质量的关键工具。
图1 AAV关键质量属性的表征【1】
分析型超速离心技术(Analytical Ultracentrifugation,AUC)是表征生物大分子特性、研究生物分子理化性质的主要技术手段之一,用于分析样品异质性、聚集体的形成以及分子间相互作用等。贝克曼推出的Optima AUC分析型超速离心机由主机、光学系统、转头以及样本池组件等构成,可以想象成是一台制备型超速离心机和光学检测系统的结合,但不同于制备型离心机,Optima AUC作为分析型仪器可以实时监测样品沉降过程中溶质浓度随时间和距离的改变,从而计算得到分子特性,例如沉降系数等。
正如图2所示,AUC检测时直接将溶液中的样品放入样品池中,然后置于转子内放入腔体离心,通过光学检测器收集样品浓度随时间实时变化的数据。检测前不需对样品进行标记和处理,收集原始数据后通过SEDFIT软件进行数据处理,得到c(s)分布曲线。在c(s)分布曲线中,横坐标表示样品中不同颗粒的沉降系数,同时对样品峰峰面积进行积分,可得到相应的百分含量。
图2 AUC样品检测流程
对于rAAV重组腺相关病毒样品来说,由于溶液中空壳颗粒、实心颗粒以及中间产物中,病毒颗粒内核酸长度的不同,其沉降系数存在较大差异。在PBS溶液中,AAV空壳颗粒沉降系数约为60S-64S,实心颗粒依据包裹核酸长度的不同,沉降系数分布在75S-110S之间,大于120S的峰我们一般认为是病毒颗粒的聚集体。如图3所示,AUC检测分析后,可以区分量化样品中的多个组分,包括空病毒颗粒、包含全基因组的病毒颗粒、包括部分基因组的病毒载体,以及载体碎片与聚集体等。通过监测AAV载体的性质,可以筛选确定最佳生产和纯化工艺、监测批次间一致性等,确保rAAV载体质量。
图3 AUC数据分析结果【2】
与检测AAV病毒载体空壳率的其它相比,分析型超速离心技术具备:
●高分辨率,wei一可检测中间产物及其含量的方法,是表征AAV病毒载体的金标准;
●定量检测,精确测定。与电镜、qPCR/ELISA、光密度法等估算方法相比,AUC可以做到准确定量,百分含量检测可达千分之一。
●直接检测,无需对样品进行标记,无需标准品,检测结果更接近于真实状态。
●方法简便,同一方法适用于不同血清型的AAV载体,无需再进行方法开发。
参考文献
[1] Gimpel A L , Katsikis G , Sha S , et al. Analytical Methods for Process and Product Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus-based Gene Therapies[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2021.
[2] Fu X , Chen W C , Argento C , et al. Analytical strategies for quantification of adeno-associated virus (AAV) empty capsids to support process development[J]. Human Gene Therapy Methods, 2019, 30(4):144-152.
2021-10-18相关仪器 -
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