利用HEK293T细胞开发慢病毒载体生产工艺

图1所示，LVV生产过程的概述。我们将在本文中讨论细胞培养和转染工艺的建立过程。 

本文所述工艺采用的是四质粒转染系统 (Cell Biolabs) ，包括两个包装载体，一个包膜载体和一个携带绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因的表达载体，及PEI MAX (Polysciences) 转染试剂。聚乙烯亚胺 (PEI) 与质粒DNA产生带正电的复合物，质粒DNA通过内吞作用进入细胞并将DNA传递到细胞核，使外源DNA的基因在293细胞体内表达（图2）。

我们将在HyClone DMEM培养基和10%胎牛血清 (FBS) 中贴壁生长的HEK293T细胞，消化后直接转移到HyClone PEM培养基中进行传代培养，经10次传代后，通过观察悬浮细胞的生长和形态，确定细胞已完全适应无血清悬浮培养。 

PEM培养基是即用型的无血清293培养基，含有稳定型L-谷氨酰胺和泊洛沙姆188。  

DoE研究采用全因子设计，包括5个参数（活细胞密度、孵育时间、增强剂浓度、增强剂添加时间和DNA浓度），以评估转染的Z佳条件。在我们的DoE开发过程中，设定的标准是达到10¹⁰个病毒颗粒 (VP/mL) 和10⁷个转导单位 (TU/mL) 。 

实验结果发现，每一个条件的优化都可以使病毒滴度超过DoE设定的标准。 

为了摸索转染Z适合的活细胞密度 (VCD) ，我们没有进行额外的DoE，而是进行了一个简单的实验。其中只测试了三个不同的VCD和孵育时间，并根据DoE的结果设置了所有其他参数。实验结果表明，活细胞密度为3×10⁶个/mL，孵育时间为5 min，可以获得Z大滴度（图3）。

首先，将HEK293T细胞在摇瓶中扩增，产生足够的细胞用于接种到Xcellerex XDR 10。在反应器中初始培养基体积为5 L，接种细胞密度为0.4×10⁶个/mL。接着扩增细胞72 h到细胞密度约为3×10⁶个/mL。随后加入HyClone PEM培养基稀释培养体积至约9.2 L。 

接种96 h后按优化方案进行转染。将转染复合物加入反应器中，Z终反应器体积为10 L，细胞浓度为3×10⁶个/mL。转染5小时后，加入终浓度为10 mM的丁酸钠。转染72小时后收获。Xcellerex XDR 10中三个批次的结果如图5所示。所有三次生产结果的病毒滴度均高于接受标准。

图5所示，在Xcellerex XDR 10中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染，转染72 h后收获。 

为了确认Xcellerex XDR 10的转染效率，除了流式细胞术分析外，我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光的评估。图6为收获时LVV稀释样品中GFP阳性荧光细胞。

图6所示。(A) Xcellerex XDR 10收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。

所有三个生产批次的病毒滴度相似，约为10¹⁰ VP/mL和10⁷ TU/mL（图7）。所有三个批次之间的一致性表明工艺设计是稳健的，适用于生产目的。 

图8所示，在ReadyToProcess WAVE 25中三次生产LVV的细胞生长和活率。接种96 h后转染，转染72 h后收获。 

为了确认ReadyToProcess WAVE 25的转染效率，除了流式细胞术分析外，我们还对细胞在显微镜下进行了明场和荧光评估。图9为收获时LVV稀释样品中GPF阳性荧光细胞。

图9所示，(A) ReadyToProcess WAVE 25收获LVV时的明场和 (B) 荧光显微镜图像。 

所有三个生产批次的病毒滴度相似，约为10¹⁰ VP/mL和10⁷ TU/mL（图10）。