2021盘点收藏 | 一文了解自动化NGS文库制备进展

       基因测序技术的不断突破，加速了测序行业蓬勃发展和快速增长。NGS的广泛应用不断催生对高效率、高通量、标准化的需求。2021年液体处理专家贝克曼库尔特在自动化NGS文库制备上提出多种应用方案。从安德森癌症中心开发基于声波移液的声学细胞标记技术用于单细胞测序，到逐步丰富自动化捕获测序试剂盒清单，再到如何平衡高通量、低成本的NGS建库，如何完成多快好省的质控，囊括了NGS建库从始到终各个步骤。

Nature单细胞测序新技术

-- ACT声学细胞标记

       受到可测序的肿瘤细胞数目限制，第 一代单细胞DNA测序技术噪音的影响，解析肿瘤细胞群中拷贝数的微小差异非常困难。德克萨斯大学安德森癌症中心Nicholas Navin博士团队开发了基于ACT（Acoustic Cell Tagmentation）声学细胞标记的单细胞DNA测序新方法。1

       ACT（Acoustic Cell Tagmentation）声学细胞标记，采用贝克曼库尔特Echo声波移液技术2-3（ALT, acoustic liquid transfer），利用声波能量快速、高效转移低至2.5nL小液滴，完成单细胞DNA文库制备。ACT建库仅需3小时完成，且表现出相较其他三种同类方法显著改善的覆盖度和技术噪音。

图：ACT声学细胞标记单细胞测序工作流程

       据悉，Echo采用声波能量隔空打液，无需接触，无需使用吸头等物理媒介。同时可实现动态液体分析，通过声能判断液体组成成分、液体高度，计算出向目标板中转移准确体积所需的能量，实现低至2.5nL的准确移液。

高通量vs.低成本

       随着NGS测序成本下降，文库制备试剂盒成本和人力成本的比重逐渐凸显。如何有效平衡日益增加的样品通量需求和成本控制？贝克曼库尔特创新推出Biomek+Echo超高通量自动化整合系统，帮助研究人员实现NGS文库构建中高通量和低成本。

图. Biomek+Echo整合系统

       Biomek+Echo自动化NGS建库方案结合声波移液和自动化液体处理工作站，具备从纳升至微升的精 准移液及自动化处理功能。该系统可将NGS化文库制备微量化缩小20倍，降低每次反应的试剂成本。同时，提高单次处理样品处理通量至384个。完成384个样品的文库制备仅需4小时，且该时间包括试剂分装和孵育。研究团队利用3种不同的微生物样品类型（蜡状芽孢杆菌、大肠埃希氏菌、红球菌）进行实验，测试了该微量化方法的有效性。

Panel看这里，手工数据vs.自动化数据

       靶向测序是针对基因组特定目标区域的测序技术。针对目标区域深度测序，增加了检查灵敏度和准确性，既能满足研究、检测需求，又降低了测序成本，在科研、临床中均备受关注。随着靶向测序应用日益广泛，特别是在肿瘤基因检测市场的激增。采用自动化来提高工作效率和结果重复性，标准化工作流程的必要性不断上升。

       贝克曼库尔特推出基于Biomek 自动化工作站的靶向测序方案，已成功自动化一系列商品化靶向测序试剂盒，包括Agilent、Illumina、NEB、Roche等公司的试剂盒（点击【你在用这些靶向测序试剂盒吗？来看杂交捕获人机对比】查看完整列表）。以IDT xGen® 杂交捕获试剂盒为例，我们比较了Biomek自动化实验数据和手工数据，自动化表现优异。

图：IDT xGen® 杂交捕获试剂盒历史手工数据（左）vs. Biomek i7自动化工作站（右）完成数据。A. 平均中靶率，B. 重复率，C. 覆盖度，D. GC偏移。

文库质控怎么做才多、快、好、省

       NGS文库质控实验是上机测序前的关键步骤，包括荧光染料法浓度测定，文库片段大小分析，qPCR定量，文库浓度归一化和混样。贝克曼库尔特创新推出基于Echo声波移液的Scale-down（缩小反应体积）方案。

       文库dsDNA片段荧光染料定量体系仅仅10μL。384孔板、1536孔板超高通量文库qPCR定量体系可缩小至2μL，1μL甚至500nL。微量化有效减少试剂消耗，控制成本。声波隔空打液不直接接触样品，避免标准品梯度稀释的累积误差。

       另一振奋的创新点在normalization和pooling。贝克曼库尔特采用Echo声波移液系统进行nL至μL级灵活的液滴转移，将浓度归一化和混样简化为一步进行。12分钟即可完成384个文库混样，而手工实验需要约6小时。

图：Echo一步法NGS文库Pooling：将需要混样的各文库信息写入输入文件，Echo将根据文件信息挑选不同孔不同体积液体完成pooling。

参考文献

1. Minussi, D.C., Nicholson, M.D., Ye, H. et al. Breast tumours maintain a reservoir of subclonal diversity during expansion. Nature 592, 302–308 (2021). https://doi.org/10.1038/s41586-021-03357-x

2. US Patent 6938987

3. US Patent 6938995