STAR Protocols | CAR-T细胞趋化与杀伤评估解决方案

目前实体瘤细胞治 疗的主要障碍是效应细胞难以进入到肿瘤组织中，克服这一挑战的主要策略就是增加效应细胞进入肿瘤组织的趋化特性。2021年Lesch等人在Nature Biomedical Engineering上提出了一种anti-MSLN CAR-T 细胞，其细胞表面同时高表达C-X-C趋化因子受体6（CXCR6），能够增强T细胞对胰 腺癌细胞的识别和裂解，从而增强治  疗 效果。因此，需要一个系统的方法对这种存在趋化能力的CAR-T细胞的迁移和细胞毒性能力进行评估。

近日，科学家在STAR Protocols发表了一种实验方案：“Transwell migration assay to interrogate human CAR-T cell chemotaxis”，该方案详细描述了T细胞的分离和激活，转导和扩增，迁移实验以及杀伤实验。其中在迁移杀伤实验中结合了Transwell与基于阻抗的xCELLigence real-time cell analyzer (RTCA)系统，为CAR-T的趋化潜力筛选提供了一个可靠的方案。

图1. 完整实验流程图

联合实验步骤

1. 接种靶细胞 到E-plate

1.1 将培养基等其他试剂预热到37℃，取出E-plate 96孔板并加入50μL杀伤培养基，将E-palte放入RTCA cradle上进行基线扫描（step1）；

1.2 将靶细胞（MSLN-CXCL16-过表达SUIT-2细胞（SUIT-2-MSLN-CXCL16细胞））接种到E-plate中，100μL/孔，根据不同细胞类型可接种5,000-10,0000个细胞每孔，接种后将细胞置于室温平衡静置45-60min使细胞完全沉降；

1.3 静置后将E-plate置于RTCA cradle，启动RTCA实验的step2进行细胞增殖的实时监测，直到增殖到合适的Cell Index值（例如1-2）；

2. Transwell 迁移经验

2.1 接种2.5 x 104 SUIT-2-MSLN-CXCL16细胞/孔到TC处理的Transwell下室，终体积在225μL的培养基中，置入培养箱中培养24h；

2.2 24h后，收集效应细胞（anti-MSLN-CAR-T and anti-MSLN-CAR-CXCR6-T细胞），并将细胞浓度调节到5 x 105 cells/70μL；

2.3 取出Transwell板，将上室放入板中，并将70μL效应细胞加到上室中，轻轻地盖上盖子，不要施加任何压力，然后将板转移到培养箱中。让细胞迁移4小时。

3. 接种效应细胞到E-plate

3.1 确保E-plate中的靶细胞增殖到合适的Cell Index值，然后将迁移结束的Transwell板子轻轻取出，用棉签将上室中的液体完全去除，确保没有破坏Transwell膜，并轻轻取下上室；

3.2 暂停RTCA运行步骤（step2），并进入下一步骤（step3），当step3第 一次扫描结束后立即暂停实验，并轻轻取下E-plate；

3.3 将Transwell下室中迁移的CAR-T细胞轻轻混匀，从其中取出100μL迁移的CAR-T细胞加入到E-plate中进行靶细胞的杀伤，盖上盖子后将E-plate继续放入RTCA仪器中并继续数据的采集。

图2. 迁移与细胞杀伤联合试验图示

结果与讨论

迁移实验中，将迁移到下室的CAR-T细胞进行计数，以anti-MSLN-CAR-T细胞为基准1，得出趋化指数，CXCR6武装的anti-MSLN-CAR-T细胞趋化指数1.5左右，结果表明CXCR6明显增强了CAR-T的趋化能力（图3.A）。同时检测迁移到下室的CAR-T细胞的CAR阳性比例，与迁移前的阳性比例对比（蓝色），CXCR6武装的anti-MSLN-CAR-T细胞迁移到下室的CAR阳性细胞比例更高（橘色），而对照组anti-MSLN-CAR-T细胞迁移到下室的CAR阳性细胞比例降低（图3.B）。

迁移后杀伤实验在实时无标记的RTCA上进行，其中迁移的CXCR6武装的anti-MSLN-CAR-T细胞组的cell index最 低且保持持续下降（图3.C），表明其杀伤能力最 强，CXCR6增强了CAR-T细胞的趋化能力并发挥更强的抗肿瘤活性。因此用肿瘤特异性趋化因子受体武装肿瘤特异性T细胞是有希望实现实体瘤过继细胞治 疗的策略。

图3. 细胞迁移与细胞杀伤结果

综上所述

Transwell迁移实验结合依赖阻抗的实时无标记细胞分析（RTCA）进行细胞数量以及健康状态的监测实验。使用这种方法，研究人员可以通过检测CAR-T细胞的细胞毒性能力以及它们的迁移潜力，为CAR-T趋化能力分析引入一个新的维度。