【热点应用】看GCI 技术如何攻克小分子药物实验难题

转移性结直肠癌 （mCRC） 是导致癌症相关死亡的主要原因之一，但目前仍缺乏有效的治疗药物。岩藻糖基转移酶8（FUT8）在结直肠癌在内的大多数恶性癌症中过表达，为潜在的治疗靶点。

2023年8月3日，苏州大学汪维鹏教授和李环球副教授团队在Cell Death Disease上发表题为 “FDW028, a novel FUT8 inhibitor, impels lysosomal proteolysis of B7-H3 via chaperone-mediated autophagy pathway and exhibits potent efficacy against metastatic colorectal cancer” 的研究性文章，该研究开发了一种强效且具有高度选择性的小分子 FUT8 抑制剂 FDW028，该抑制剂能显著抑制FUT8介导的核心岩藻糖修饰，促进免疫检查点分子B7-H3经分子伴侣介导的自噬（CMA）溶酶体途径降解，显著延长转移性结直肠癌（mCRC）小鼠生存期。

图1 FDW028 药理作用机理

目前，通过常规策略开发的小分子抑制剂，面临生物利用度低、选择性差等问题。因此，研究者借助分子动力学（MD）模拟、虚拟筛选等技术，解开了FUT8 与小分子结合的关键残基，鉴定出FDW028有望成为FUT8 的新型抑制剂。最终，研究者利用小分子开发黄金搭档——GCI，将FUT8通过氨基偶联于PCP芯片表面，FDW028以1:2进行稀释流过芯片表面（8个浓度，最高浓度为100 μM），运行缓冲液为含3%DMSO的PBS-P缓冲液。通过Kinetics测定出FDW028和FUT8亲和力为5.486 μM，证实了 FDW028 与 FUT8 的完美结合，进一步验证了FDW028作为酶抑制剂的可行性，为后续动物实验抗肿瘤活性的评估奠定坚实的基础。

图2 FUT8和FDW028结合动力学

在小分子结合实验中，特别是在分析大分子量药物靶标与小分子之间的相互作用时，灵敏度是实现精准分析的核心要素。

传统技术面对悬殊较大的分子互作分析时，往往需通过提升表面配体的密度来实现Rmax（最大响应值）的最优化，以确保结果的可靠性。然而，高分辨率的GCI技术可以精准捕获较低配体密度下的动力学数据，为研究分子间相互作用提供了新的视角和更宽的动态范围。

基于GCI技术我们分析了一对分子量为297 Da的小分子与分子量为110 kDa的目标蛋白（由诺华公司提供），分子量比率>350:1，这对于传统的无标记互作技术来说是一个巨大挑战。将生物素化的目标蛋白偶联在PCH-STA芯片表面（表面衍生链霉亲和素），分析物进行1:3稀释（9个浓度，最高浓度为10 μM），运行缓冲液为20 mM Hepes、300 mM NaCl、1 mM DTT、2%DMSO，最终通过校正及拟合以获得结合动力学相关信息。

图3 297 Da小分子与110 kDa的目标蛋白的结合动力学

借助GCI技术卓越的灵敏度和信噪比，即使在配体密度远未达到表面饱和的情况下（<1 pg/mm2，相当于1 RU），也能对分子量相差悬殊的相互作用进行可靠测试。这使我们能够获取具有清晰的浓度依赖性和高信噪比的优质数据。

参考文献：

[1] Wang, M., Zhang, Z., Chen, M. et al. FDW028, a novel FUT8 inhibitor, impels lysosomal proteolysis of B7-H3 via chaperone-mediated autophagy pathway and exhibits potent efficacy against metastatic colorectal cancer. Cell Death Dis 14, 495 (2023). DOI：https://doi.org/10.1038/s41419-023-06027-0.

[2] Creoptix TechNote08 Large Drug Targets.

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