Copure 肝素免疫亲和柱|牛奶和奶粉中的乳铁蛋白的测定

1.试样制备

1.1 液态试样（纯牛奶）的制备与提取：

称取试样5g(精确到0.01g)置于50ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液Ⅱ定容至25ml，涡旋混匀，在4℃下以10000r/min转速离心12-15min，取上清至另一50ml离心管中，4℃下以10000r/min转速离心12-15min，取上清液备用。

1.2 固态试样（婴幼儿配方奶粉）的制备与提取：

称取试样5g(精确到0.01g)置于50ml离心管中，用温热（温度不超过50℃）的磷酸盐缓冲溶液Ⅱ将其溶解，最终定容至50ml，涡旋混匀，在4℃下以10000r/min转速离心12-15min，取上清至另一50ml离心管中，4℃下以10000r/min转速离心12-15min，取上清液备用。

磷酸盐缓冲液Ⅰ:称取 7.1g磷酸氢二钠、58.4 g氯化钠,加 900 ml水溶解,用磷酸调 pH 至 8.0± 0.2,加水定容至 1 000 mL,临用现配。

 磷酸盐缓冲液Ⅱ:称取 28.4g磷酸氢二钠,加 900 m1,水溶解,用磷酸调 pH 至 7.5±0.2,加水定定容至 1 000 mL,临用现配。

2、试样净化：

将10ml注射器连接于肝素免疫亲和柱上端，先加入5ml磷酸盐缓冲液Ⅱ活化免疫亲和柱，准确移取10ml样液，控制流速在1ml/min~3ml/min，待样液完全流出后，用10ml磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗，弃去全部流出液。准确加入5mL磷酸盐缓冲液Ⅰ洗脱，收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.00mL，混匀过水系滤膜，供HPLC分析。

色谱柱：CommaSil? C4,5um,300 ?，250mm×4.6mm
流速：1.0 mL/min
检测器：紫外检测器，波长280nm
进样体积：50uL
流动相：0.1%三氟乙酸与乙腈梯度洗脱，见下表：

        图1 40ppm标准溶液乳铁蛋白液相色谱图

图2 牛奶本底及加标液相色谱图

图3 婴幼儿奶粉本底及加标液相色谱图