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解决方案
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18种天然氨基酸分析(异硫氰酸苯酯柱前衍生法)
发布:北京迪科马科技有限公司浏览次数:1372- 方法:
- HPLC
- 基质:
- 氨基酸注射液、动植物性食品和饲料
- 应用编号:
- 102377
- 化合物:
- Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸
- 色谱柱:
-
Diamonsil AAA 5μm 250x4.6mm
- 样品前处理:
溶液配制
氨基酸储备液: 称取一定量氨基酸标准品,用0.1 mol/L HCl水溶液溶解,胱氨酸为0.01 mol/L,酪氨酸为0.02 mol/L,其他氨基酸为0.05 mol/L
氨基酸使用液: 将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释,得到浓度为0.002 mol/L的氨基酸单标和混标
内标液: 以正亮氨酸作为内标物。称取一定量正亮氨酸,溶于0.1 mol/L HCl水溶液,得到0.02 mol/L的正亮氨酸内标液
异硫氰酸苯酯溶液: 将250 μL异硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至10 mL,得到0.2 mol/L异硫氰酸苯酯溶液
三乙胺溶液: 将1.4 mL三乙胺用乙腈定容至10 mL,得到1.0 mol/L三乙胺溶液衍生化
样品溶液衍生化
量取200 μL 样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)[1],置于1.5 mL 塑料离心管中,加入20 μL 正亮氨酸内标溶液[2],混匀,再加入100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,室温反应1小时,然后加入400 μL正己烷,旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合[3],0.22 μm 针式过滤器过滤,待分析。
标准溶液衍生化
量取200 μL氨基酸混合标准溶液(每种组分浓度均为0.002 mol/L),置于1.5 mL塑料离心管中,准确加入20 μL正亮氨酸内标溶液[2]、100 μL 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液,混匀,室温反应1小时,然后加入正己烷400 μL,旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s,静置分层,取200 μL下层溶液与800 μL水混合[3],0.22 μm针式过滤器过滤,待分析。注:
[1] 通过控制原始样品质量或稀释等方法,使样品溶液中的氨基酸总量不超过0.04 mol/L或3.0 g/L(两者中取Z小值)
[2] 只有采用内标法分析时,才需要加入正亮氨酸作为内标物
[3] 衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈,这与流动相溶剂体系存在较大差距,因而需要加水稀释,否则会引起峰前沿或分叉
- 色谱条件:
分析条件
仪器: 二元高压HPLC系统
色谱柱: Diamonsil AAA 250 × 4.6 mm,5 μm(Cat.#:99751)
流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)
流动相B: 甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)
流速: 1.0 mL/min
检测波长: UV 254 nm
柱温: 45 ℃
进样体积: 10 μL
梯度程序时间/min
0
39
40
45
46
60
流动相A/%
95
52
0
0
95
95
流动相B/%
5
48
100
100
5
6
- 文章出处:
- 迪马科技应用实验室
- 关键字:
- 氨基酸注射液, 动植物性食品, 饲料
- 摘要:
该方法适用于氨基酸注射液、动植物性食品和饲料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸的检测。
- 图谱:
18种天然氨基酸、正亮氨酸以及NH3(氨)-异硫氰酸苯酯衍生物的液相色谱图
1 Asp(天冬氨酸) 2 Glu(谷氨酸) 3 Ser(丝氨酸) 4 Gly(甘氨酸) 5 His(组氨酸) 6 Arg(精氨酸) 7 Thr(苏氨酸) 8 Ala(丙氨酸) 9 Pro(脯氨酸) 10 NH3(氨) 11 Tyr(酪氨酸) 12 Val(缬氨酸) 13 Met(蛋氨酸) 14 Cys(胱氨酸) 15 Ile(异亮氨酸) 16 Leu(亮氨酸) 17 Nle(正亮氨酸) 18 Phe(苯丙氨酸) 19 Trp(色氨酸) 20 Lys(赖氨酸)
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