凝胶成像

　　凝胶成像是对DNA或RNA胶进行切胶、拍照、观察、分析，凝胶成像系统可以应用于分子量计算、密度扫描、密度定量、PCR定量等生物工程常规研究。

凝胶成像系统的发展

　　凝胶成像由CCD摄像系统和暗箱组成的硬件和不断发展的计算机软件组成。

　　1、硬件的发展

　　(1)CCD影像系统：这是凝胶成像分析系统的核心装置。CCD是一种矽晶片，能将光的影像元素转换为电子量，使影像数值化以后作为电脑影像处理或储存。

　　CCD有video CCD相机和高性能CCD相机两种。前者即电视规格摄像机，通常用于一般影像分析，但无数值影像处理功能。后者为科学用CCD系统，可以获得高解析度，高动态范围，低噪声的影像，特别是近几年使用的冷却式CCD摄像系统，大大降低了暗电荷，几乎达到无噪声的境界。其分辨率可以从几十万达到几百万个图像元素。

　　(2)暗箱：现代已由简单的紫外线UV透射暗箱发展成为多功能的暗箱，箱内双侧安装白灯，可以进行反射分析，也可以安装254nm反射UV灯，用于TLC板分析，黑板上搁置白板，可以进行白光透射的测量。

　　2、软件的发展

　　针对生命科学的多种实验要求，不断发展升级的计算机软件，是凝胶成像系统成为当代生物化学与分子生物学实验研究必不可少的主要设备原因。

　　(1)1D区带分析：一维软件可分辨50多条区带，根据峰图显示，可以准确的选定峰值，删除泳带的拖尾现象，获得比较准确的积分吸光度，进行定量计算。

　　(2)分子量(MW)与迁移率(RF)的计算：电泳和层析形成的区带和斑点，其RF值可以自动进行测定计算。蛋白质和核酸(DNA和RNA)的MW，在有标准分子量的区带存在下，可以直接自动计算。蛋白质的标准分子量一般有高、中、低三种。DNA的标准分子也有多种。

　　(3)斑电的分析有圆形和矩形分析两种方法。根据斑点大小，可以调整半径、长短边，获得每个斑点面积上的积分光密度。

　　(4)2D点密度分析，是近年来针对生命科学发展到后基因组时代，出现的蛋白质组分析设计的软件，此软件可选定区域设定灰度、计算光密度、确定像素、对上千个双向电泳斑点进行量的分析。更高一级2D软件，能自动识别、定量比较2D蛋白质凝胶图像，自动计算2D凝胶上蛋白质点的分子量和PI值，进行蛋白质匹配，与自动切割蛋白质点工作站相连接，快速进行蛋白质组的分析。

凝胶成像系统的功能

　　由于多功能暗箱和计算机软件功能的不断发展，影像分析系统已可应用于生命科学研究的多个方面。

　　一般功能：DNA/RNA、蛋白胶、DOT/Blue/Slot TLC板、ELISA、显微照片、克隆计数及细胞计数等。

　　比色分析：考马氏亮兰、银染等。

　　化学发光：AFLP、Western、Southern、Northem自显影分析。

　　荧光分析：EtBr、SYBGreer、Gold、SYPRORED、Orange、Hoeches Blue、Rhodamine、多色荧光分析。

　　化学荧光分析：结合荧光与化学发光。

　　此外，多数暗箱上侧只安装白光灯，分析发荧光的TIC板时，由于玻璃不透紫外线，不能进行测定，可以将玻璃板反放在黑板上，即薄层面向黑板，其发出荧光波长可见，能够进行测定。如果已经用铝板进行薄层层析，那只能在暗箱上侧安有紫外管灯的箱中进行分析测定。

凝胶成像系统的应用

　　1、图象摄取

　　计算机凝胶成像系统采用数码摄影将摄取的图象直接输入计算机系统。在暗箱中的紫外灯照射下，通过调节变焦光圈、变焦倍数及焦距使样品清晰及大小适当。

　　图象摄取获得以后，通过凝胶成像系统软件中图象处理菜单的“亮度”和“优化”项进行亮度调整和图象优化，以降低图象本底噪声。

　　一般经过这样处理以后能得到清晰的凝胶图片，同时在图象中加入文字信息进行适当注释，用热敏打印机或现在常用的高品质照片级喷墨打印机(如EPSON的PHOTO系列)打印以后可以得到符合文章发表要求的照片打印。

　　2、分子量定量

　　对于一般常用的DNA胶片，利用凝胶成像系统中分子量定量功能，通过对胶上DNA Marker条带的已知分子量注释，自动生成拟合曲线，并以它衡量得到未知条带的分子量。通过这种方法所得到的结果较肉眼观察估计要准确很多。

　　3、密度定量

　　一般常用的测定DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)浓度的方法是紫外吸收法，但它只能测定样品中的总核苷酸浓度，而不能区分各个长度片段的浓度。但利用凝胶成像系统软件，对于DNA胶片上某一已知其DNA含量的标准条带，在调节阀值和积分框并进行密度标定以后，可以方便的单击其他未知条带根据其光密度值得到其DNA含量。

　　凝胶成像系统比紫外吸收法方便，可以测出不同长度的片段的含量，而所得结果对于分子生物学操作要求的准确度是足够的。值得指出的是，此方法也适用于对PAGE蛋白胶条带的浓度测定。

　　4、密度扫描

　　在分子生物学和生物工程研究中，Z常用到的是对蛋白表达产物占整个菌体蛋白的百分含量的计算。传统的方法是利用专用的密度扫描，但利用生物分析软件结合现在实验室常规配备的扫描仪或者直接用白光照射的凝胶成像就能完成此项工作。

　　以凝胶成像系统为例，选择密度扫描命令，将代表某一微生物菌株的泳道图象用虚线框住以后，即可得到对此区域的纵向扫描曲线图。一般选择缺省的自动积分选项可以自动计算出对应于各个胶带的每个峰面积相对于整个曲线所占的百分比，也可以选手动积分人工选择积分区域，对于某些条带较弱，本底较高的图谱可以进行基线调整以得到更佳的实验结果并在误差的允许范围内。

　　5、PCR(聚合酶链式反应)定量

　　PCR定量主要是指当做PCR实验时如果扩增出来的条带不是一条时利用此命令可以计算出各个条带占总体的相对百分数，就此功能而言与密度扫描类似，但实际在原理上并不相同。

　　PCR定量并不对选择区域生成纵向扫描曲线图并积分，而是对选定的几条带进行相对密度定量并计算其占总和的百分数。