饮用桶装水菌落总数怎么检测

从事口罩微生物检测的朋友都知道，在菌落总数检测时，经常添加TTC这种物质，哪什么是TTC？添加TTC又有什么作用？

TTC：俗称红四氮唑，学名2,3,5-三苯基氯化四氮唑，化学式如下：

在菌落总数检测时，添加TTC可以起到两方面的作用：

其一，TTC可以使菌落显红色，便于区分菌落和杂质，更利于计数；

其二，TTC可以有效的防止平板上的菌落蔓延情况。这两种作用的原理是不同的，TTC溶于水是无色的，而嗜中温性需氧菌在新陈代谢过程中产生的琥珀脱氢酶可以使无色的TTC被还原成红色的TPF，使菌落显色，这是显色的原理；同时TTC还具有YZ某些革兰氏阳性菌生长的作用，因此会防止菌落蔓延。但既然会YZ细菌的生长，那会不会造成检测误差呢？其实只要合理使用，注意添加量，对检测结果的影响并不是很大，是可以忽略不计的。

有专家对此做过实验，实验结果表明培养基内TTC浓度在0.0003%-0.001%（w/v）的范围内对菌落生长YZ作用不显著，但浓度太低菌落的显色效果并不是很好，因此推荐大家按照TTC浓度为0.0005%的量来添加就不会对检测结果产生较大影响，还会使菌落显色方便计数。为了方便大家在检测过程中方便添加，润扬仪器小科特意做了一个表格，方便大家查询：

除了添加量之外，菌落总数检测时使用TTC过程中我们还应该注意以下几点：

要点1：TTC的配制过程，一定要在无菌条件下进行。因为我们配制好的TTC溶液在检测时是直接加入到培养基中的，必须保证TTC溶液时无菌的，配制用水也必须是无菌水。

要点2：TTC具有比较强的光敏性，见光易分解，因此无论是TTC粉末还是配制好的TTC溶液都要注意避光冷藏保存，配制好的溶液一定要放在棕色的试剂瓶里。

要点3：TTC溶液要在菌落总数检测过程中直接加入灭菌完的培养基中，即在倾倒平皿之前加入培养基然后摇匀使用。尽量不要将TTC溶液加入培养基后一起灭菌，这样操作会使培养基颜色加深，不利于显色和计数。

要点4：若显色效果不是很好，可以考虑提高一下TTC浓度，但不要超过0.001%的浓度，否则会使检测结果出现比较大的偏差。

要点5：加TTC溶液还可以有效的控制平板培养基上的菌落蔓延情况，若是添加试剂的主要目的是为了控制菌落蔓延，建议增加培养基中TTC的浓度，浓度大约0.0008%时就会起到比较好的效果，并且不会影响结果。

任何方法都会是双刃剑，添加TTC显色当然也是如此，添加TTC蕞主要的问题就是它的YJ作用，会造成检测结果偏低，因此很多人不愿使用。其实若是不存在杂质干扰或者一些特殊情况可以比较准确的计数，润扬仪器小科也建议大家不要一昧因为显色之后容易计数就进行添加，毕竟这只是在一些特殊情况下采用的非常规手段。

　　菌落总数(Totalcoliforms)是判定水质被细菌污染程度的重要指标之一，其测定方法也有一定的标准。平皿计数法是早期传统的水中菌落总数标准检测方法，其应用研究也比较多，如钱冬梅应用平皿计数法测定了生活饮用水中的菌落总数。这种方法实验步骤较为繁琐，对操作人员的专业水平要求比较高，不适用于应急快速检测，无法对水的卫生状况做出快速评价。

　　酶底物法是近些年来新兴的水中菌落总数检测方法，操作简便，结果易判断，适用于快速检测。但不少用户对此种方法存疑，不知道这种方法出来的检测结果是否科学准确，下面优尔普就以平皿计数法的检测结果为准，用酶底物法程控定量封口机进行实验检测对比。

立科酶底物法程控定量封口机

酶底物法快速检测水中菌落总数实验

一、实验操作部分

1、实验原理

　　酶底物法使用的复合酶技术培养基包含多种独特的酶物质，每种酶物质都针对不同的细菌酶设计(包含普遍的水介传播细菌)，所有的酶底物被分解时均产生相同的信号。在检测菌落总数时，这个信号显示为365纳米紫外4O城镇供水NO.22013灯下的荧光。

2、材料与试剂

　　立科定量盘、lmL移液管或移液枪、10mL移液管或移液枪、培养箱(35±1)、6瓦366FIITI紫外灯、紫外灯箱(23cmx30onx17on1)、无菌水。

3、方法步骤

酶底物法检测方法操作步骤

(1)首先向100mL装有固体培养基的瓶中加入无菌水至刻度，摇匀，制成液体培养基，然后放置在冰箱中保存，使用有效期为5天。见图1。

(2)取1mL水样及9mL液体培养基倒入立科定量盘中。见图2。

(3)将定量盘盖好，在水平桌面上旋动将所有水样分配到定量盘的孔中(孔中的气泡不会影响结果)。见图3。

(4)将定量盘竖起呈垂直90度，将多余的水样由盘内海绵吸收。见图4。

(5)将定量盘缓慢翻转过来，于培养箱中(35±0.5)培养48h(若结果为可疑阳性则延长培养时间至72h)。见图5。

(6)计数：培养完成后将培养盘盖打开，用紫外灯在定量盘上方13on处照射，数显荧光的孔数。对照MPN表得出结果。注意：海绵条显荧光不必记录在读数范围内。由于本方法的Zda检测上限为738MPN/mL，如需稀释时，将结果乘以稀释倍数即为报告读数(如稀释l0倍时的操作为：加入0.1mL样品和9.9mL液体培养基)。

二、结果与分析

1、盲样比对实验--T检验分析

　　选取三个水质检测实验室对比同一盲样(标准试剂)进行酶底物法和平皿计数法比对试验，具体试验结果如图。

EPA标准盲样检测结果

　　对比以上酶底物法和平皿计数法检出共160个结果进行配对T检验，两种方法的配对T检验结果如下表。

配对检验结果

　　标配比变量差值的T检验结果，Mean均值之间的差值为-1.78750，Std.Deviation差值的标准差16.10385，Std.ErrorMean差值的调准误为1.80047，95%ConfidenceIntervaloftheDifference置信区间上下限为-5.37124和1.79624，t-valuet值为-0.993，df自由度为79，Sig(2-tailed)双尾T检验的结果，获得t值的概率P值为0.324，检验结果表明酶底物法和平皿计数法检测结果没有统计学意义上的差别(P<0.50)。

2、水样检测--线性回归分析

　　采集地表水水样进行检测，为保证实验结果的有效性和方便统计，要求检测高、低浓度两个水样，同时，要求低浓度水样的MPN值控制在50MPN/ml左右，高浓度水样的MPN值控制在100MPN/ml左右，分别从国内9个地区采集水样，试验结果如图。

实验室水样检测结果

　　对以上9家实验室用酶底物法和平皿计数法共1160个检测结果进行线性回归统计分析，两种方法线性回归分析见下表。

检测结果线性回归统计分析

　　从图表中可知，标准化回归系数Beta为0.95，表明两组数据相关性较好，两种方法的检测结果具有可比性。检验结果P=0.00，均小于0.05，表明两种方法在检测菌落总数时没有显著差异性，具有等效性。此结果说明酶底物法的测定结果准确、可靠，可以替代平皿技术发作为水中菌落总数的测定方法。

　　从上述实验可以看出，酶底物法快速检测水中菌落总数的检测结果与平皿计数法无统计学意义上的差别，是科学的、有效的、准确的，可以用作评价水质微生物污染的标准依据。酶底物法操作简单，结果判读容易、准确，无需稀释即可检测738个/1mL水样，不仅适用于水源水、饮用水的检测，还适用于应急检测和污水检测，易于推广，可以较好的弥补传统方法的不足。