干货丨你会涡旋混合吗？

实验室中的旋涡混合器，在混合少量样品时起到了非常大的作用。它混合速度快且彻底，液体呈旋涡状，能将附在管壁上的试液全部混匀，而且由于其无需在样品中加入搅动部件，避免了交叉污染。广泛用于样品前处理、生化及微生物检测等各类需快速混匀的实验任务。

涡旋混合器是利用偏心旋转原理使试管等容器中的液体产生涡流，从而使溶液充分混合。要达到WM的混匀效果，充分的涡旋很重要。但是，如果试管中样品装量过多的话，即使涡旋速度调到ZD，在液体中也只能形成紊流，而非真正的涡旋，这样一来，整个混匀效果将大打折扣。通常，会建议将试管中的装量控制在管子容量（或者高度）的2/3及以下。

下面，我们通过实验来比较一下不同装样量时的涡旋混匀效果。

01 实验方法

在15 mL离心管中加入不同量的纯水，再加入少量高浓度碱性蓝溶液，纯水:碱性蓝溶液=14:1。然后进行涡旋混合，涡旋转速：2500 rpm，涡旋时间：10秒。

02 实验结果比较

2.1 样品量为离心管容量的1/3、2/3和3/3时的比较

样品量为离心管容量的1/3、2/3和3/3时，即溶液加入量为5 mL、10 mL和14 mL。从图1可以看到，在未进行涡旋时，碱性蓝溶液是处于上层，所以，我们可以通过观察碱性蓝溶液的分散情况来判定涡旋混合是否彻底。

图1 未涡旋的情况

涡旋之后，从图2中可以看到溶液量为5 mL和10 mL时，其涡旋情况稳定，碱性蓝溶液能够在10秒内很好的与纯水混合。而溶液量为14 mL的离心管中，并没有形成稳定的涡旋，只有局部的紊流发生，在10秒之后，碱性蓝溶液并未能与纯水混合好，与未涡旋之前的状态差不多。

图2 涡旋时和涡旋后的情况

2.2 样品量为离心管容量的2/3至3/3之间的比较

为进一步比较样品量为离心管容量的2/3至3/3之间时涡旋情况，直接将2.1中涡旋后的14 mL样品用塑料滴管慢慢吸取掉一部分溶液，至离心管中溶液量分别为12 mL和11 mL。从图3和图4可以看到，在涡旋时并没有形成稳定的涡流，且伴随有局部的紊流发生。在涡旋10秒后，在离心管的底部位置能看到无色的部分，即碱性蓝溶液依旧没有与纯水完全混匀。

图3 12mL装样量涡旋时和涡旋后的情况

图4 11mL装样量涡旋时和涡旋后的情况

03 实验总结

从上述2.1和2.2的实验比较来看，样品量应控制在离心管总容量的2/3及以下时，才能在涡旋时形成稳定、WM的涡流，从而能够更好的混合样品。

这就是涡旋的正确打开方式，你记住了吗？

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注：产品仅用于科研实验！

       在4种维生素E异构体测试过程中，该如何进行键合相的选择？是否遇到过β-生育酚和γ-生育酚分离不理想、峰形差、柱压高等问题？面临这些问题，我们该如何排查和解决？

一、键合相的选择

      首先我们看一下4种维生素E的结构（如图1.1），对于反相分离模式，我们通常从极性差异来判断能否分离，从非极性看，α-生育酚>β-生育酚≈γ-生育酚>δ-生育酚，用常规C18色谱柱，意料之中，β-生育酚和γ-生育酚由于非极性差异太小，不能实现分离（如图1.2）。

图1.1  维生素E结构式

图1.2  C18分离4种维生素E异构体谱图

      同样属于反相分离模式，为什么C30色谱柱可以实现2种物质的分离呢（谱图见后续二、三、四部分）？

       首先我们看下C30色谱柱，和C18色谱柱相比，烷基链更长，由于填料的孔径都是约为120Å，孔表面键合的烷基链越长，不同位置键合的烷基链交叉重叠的可能性增大，待测组分通过孔内的阻力增大，C30分离β-生育酚和γ-生育酚依靠的是空间位阻作用。

二、“峰形差”怎么办？

2.1 流速的影响

色谱条件：

色谱柱：Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)

柱温：20℃

流速：0.8ml/min

进样量：10μl

紫外检测波长：维生素E为294nm

流动相：A：甲醇     B：水

测试结果：

      按照GB5009.82-2016第1法中色谱条件，我们发现β-生育酚拖尾，为了排查β-生育酚拖尾原因，首先尝试将流速调为0.9ml/min，β-生育酚不拖尾，在27.8min附近多一个鼓包，干扰α-生育酚的定量，不进样走流动相，也有该鼓包，说明是流动相梯度混合产生的基线波动，流速为0.8ml/min时，基线鼓包和β-生育酚出峰接近，造成β-生育酚拖尾。继续增大流速至1.0ml/min，目标物出峰时间提前，α-生育酚和基线鼓包可以分开。

      按照GB5009.82-2016DY法中色谱条件，采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 3 μm(PN: LAEQ-462553)，通过增大流速，可以避免基线波动对目标峰的干扰，另外β/γ-生育酚的分离度也得到改善。具体结果见表2.1。

表2.1 不同流速条件的结果分析

2.2 流动相的影响

      既然上述条件，β-生育酚“拖尾”是由于梯度程序造成，考虑到整个梯度程序流动相的组成差异很小，我们直接采用甲醇为流动相，也可以避免基线鼓包造成的峰形差等干扰。

总结：

      该案例中的“峰形差”是梯度流动相梯度混合产生的基线波动造成的假象，通过增大流速或者将流动相调为甲醇即可解决。

三、β-生育酚和γ-生育酚分离不理想怎么办？

3.1 流速的影响

      参考表2.1，增大流速后可以避免基线波动对目标峰的干扰，另外β/γ-生育酚的分离度也得到改善。流速是怎么影响β-生育酚和γ-生育酚分离度的呢？还是要从分离度的计算公式来看，

      增大流速后，由于色谱柱和流动相种类没有变化，选择性α保持不变，由于整个梯度程序，流动相的组成变化不大，所以k变化较小，而β-生育酚和γ-生育酚的柱效提高，所以分离度得到改善。

3.2 柱温的影响

      采用甲醇为流动相时，参考2.2中结果，β/γ-生育酚的分离度只有1.55，勉强达到基线分离，我们尝试将柱温降低为15℃，β-生育酚和γ-生育酚的分离度明显得到改善，达到1.90。

      柱温是怎么影响分离度的呢？柱温的影响相对比较复杂，它对柱效、选择性和保留因子都有影响，从而对分离度产生影响，这里就不详细分析柱温对每个参数的影响程度了。这个案例说明β/γ-生育酚的分离对柱温比较敏感，遇到分离度的问题时可以考虑降低柱温。

总结：

      β-生育酚和γ-生育酚分离不理想，梯度条件，可以通过增大流速解决，甲醇做流动相等度条件下，可以通过降低柱温解决。

四、有没有更好的选择？

      我们发现，用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm(PN: LAEQ-462552)，粒径从3 μm增大为5 μm，在满足分离度的前提下，系统压力更低哦，见表3.1。

表3.1 不同色谱条件下的对比

总结：

       采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流动相，可以实现更优的结果，α-生育酚出峰时间早、β/γ-生育酚分离度好、柱压更低。

五、总结

      5.1 遇到“峰形差”问题，首先排查是否流动相的影响，可以通过空走流动相来确认，该案例中的“峰形差”是梯度流动相梯度混合产生的基线波动造成的假象，通过增大流速或者将流动相调为甲醇即可解决。

5.2 β-生育酚和γ-生育酚分离不理想，梯度条件，可以通过增大流速解决，甲醇做流动相等度条件下，可以通过降低柱温解决。

      5.3 采用Athena C30 4.6 × 250 mm, 5 μm (PN: LAEQ-462552)，甲醇做流动相，可以实现更优的结果，α-生育酚出峰时间早、β/γ-生育酚分离度好、柱压更低。

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       标准滴定溶液：已知准确浓度的、经过均匀性和稳定性研究的、有不间断溯源链的用于滴定分析的溶液。滴定溶液制备方法有两种：

一、直接配制法

       具体操作步骤：准确称取一定量的纯物质，溶解并稀释到准确体积，根据计算求出该溶液的准确浓度。

       例如：重铬酸钾标准滴定溶液、氯化钠标准滴定溶液制备等。

直接配制法配制标准溶液的物质必须具备：

       1.必须有足够的纯度，含量≥99.9%，其杂质含量应少于容量分析所允许的误差程度。

       例如：制备重铬酸钾标准滴定溶液使用的基准物质是国家二级标准物质重铬酸钾，其含量为99.99%。

       2.物质组成与化学分子式应完全相符。若含结晶水，其含量也应与化学分子式相符。

       3. 物理性质或化学性质稳定。

二、间接配制法

       具体操作步骤：粗略称取一定量物质或量取一定体积溶液，配制成接近于所需要浓度的溶液，再用基准物质或已知浓度的标准溶液来确定其标准浓度。

       例如：高锰酸钾标准滴定溶液、盐酸标准滴定溶液、氢氧化钠标准滴定溶液、硝酸银标准滴定溶液等。

间接法制备需要的基准物质的选择要求：

1.摩尔质量大

       摩尔质量大的基准物质可以减小天平的精度原因造成的称重误差，Z终减小标定滴定溶液的误差。

       例如：标定氢氧化钠标准滴定溶液选择邻苯二甲酸氢钾作为基准物质，而不选用草酸。

2.性质稳定

       基准物质需要稳定性高、不吸湿、不风化的性质。

       例如：标定盐酸标准滴定溶液选择稳定性更高的无水碳酸钠作为基准物质，而不选用硼砂。

3.易溶解

       标准滴定溶液的标定一般都在溶液间进行，液体状态反应比较快速。容易溶解的物质能够保证标定过程的正常进行，减少反应过慢、环境等因素的影响。

4.反应终点易判断

       标准滴定溶液标定一般采用指示剂法或电位滴定法，使用的基准物质要方便反应终点的判断，基准物质的颜色不能影响反应终点的判断。

5.能产生准确的当量反应

       与标准滴定溶液之间发生化学反应的关系越简单，就越容易对参与反应的物质进行定量，通过计算得到的标准溶液的浓度数值越准确。

在色谱分析样品时，是否遇到过数据平行性不好、数据分析有杂峰？遇到这种情况时，很多小伙伴首先会分析一下实验过程、实验方法是否正确，但其实DY步应该先看看进样瓶瓶盖是否拧正确了。因为不正确的拧盖或者压盖（针对钳口瓶）也会对色谱分析产生干扰。看到这里，相信大家一定是一脸的问号。不要不相信，因为实验测试结果表明进样瓶盖拧过紧会提高产生杂峰的风险（下有测试谱图）。

下面让我们一起来看看拧盖/压盖不正确时存在的风险，以及如何判断盖子正确拧紧/压紧的状态吧！（仅以9mm的螺纹口2mL样品瓶、PP盖及PTFE/硅胶垫片举例，对于钳口瓶盖垫也是同样适用。）

一、错误的情况

1. 盖子过紧

当盖子拧得过紧时，隔垫很有可能会有明显向内凹情况。拧得越紧，隔垫内凹的情况将会越严重。此时，隔垫处在一种非常紧绷的状态。这种紧绷的状态将可能导致：在色谱扎针进样时，增加隔垫碎屑的概率，从而导致色谱分析不准确、样品的平行性不好等问题。

下图是隔垫扎针之后的GS-MS的测试谱图比较，样品瓶中溶剂为甲醇。黑色曲线为甲醇溶剂空白谱图，蓝色曲线是盖子正确拧紧的谱图，玫红色曲线是盖子拧过紧的谱图。可以明显的看出，盖子拧过紧的样品会有更多的硅氧烷峰（注意：不是100%的概率），硅氧烷峰更多则说明有隔垫碎屑掉入瓶中。实际肉眼观察样品瓶中并没有看到有隔垫碎屑，说明隔垫碎屑是非常微小的。

2. 盖子过松

当盖子拧得不够紧时，此时隔垫并没有很好的固定在盖子与瓶口之间，这将会导致：

1）样品瓶密封性不够，样品瓶中的样品更容易挥发损失，造成样品浓度不准确等问题；

2）色谱进样时，隔垫更容易被扎落。

二、正确的情况

盖子正确拧紧时，隔垫呈现的状态是平整至略微下凹的状态。通过观察隔垫的状态就可以判断盖子是否正确拧紧了，以此来调整盖子的松紧程度。对于手劲比较大的小伙伴，可能轻轻一拧，盖子就是过紧的状态了，所以需要特别注意一下。

对于钳口瓶，如果要正确的压盖，就需要调节好压盖器。以下是调整压盖器的方法：

首先，调节定位螺丝：先将锁紧螺母旋松，然后根据所需的松紧确定定位螺丝的高度（若实际压盖松了，则将螺丝高度调低；若实际压得太紧，则将螺丝高度调高），ZH将锁紧螺母旋到底部锁定位置。

其次，在仅依靠定位螺丝也不能调节好压盖器情况下，就需要用内六角扳手调整压盖器中间的螺丝。如压得太松，内六角扳手逆时针方向旋转，如压得太紧则顺时针方向旋转。

       气相色谱主要是利用物质的沸点、极性以及吸附性质差异来实现混合物的分离，气相色谱仪由六大系统组成，分别是：载气系统、进样系统、分离系统、温度控制系统、检测系统、数据处理系统。气相分析过程如图所示：

       GC基本工作原理是利用试样中各组份在气相和固定相间的分配系数不同，当样品在气化室气化后被载气带入色谱柱，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同进行分离，分离后的物质进入检测器后转化为信号，在数据处理系统中以色谱峰的显示体现，根据色谱图对物质进行定性和定量分析。

       在气相色谱分析时，经常会因为很多问题导致谱图出现异常，到底是什么原因呢？

       在此，我们将走过的弯路，积累的经验分享给您，希望对您有所帮助。

1

在溶剂验收时，纯溶剂进样后出现杂峰，就一定是溶剂有杂质？

       如果进空白针后 也存在杂峰，连续进针后，峰面积逐渐减少，优先考虑仪器系统流路问题出现的杂峰。可以从以下几个方面逐一排查：

       1）气源是否有问题；

       2）进样针，洗针瓶，隔垫，衬管，分流平板是否有污染；

       3）色谱柱是否有污染；

       4）检测器是否有污染等。

2

出现前沿峰

       1）样品过载，需稀释样品，减少进样量；

       2）载气流速过高；

       3）柱温太低，升高柱温；

       4）气化室温度太低；

       5）可能存在干扰峰，需要优化色谱条件；

       6）色谱柱选型错误，老化程度不够等。

3

出现拖尾峰

       1）衬管、分流平板或色谱柱被污染，或色谱柱安装不当，存在死体积；

       2）柱温或进样器温度低，升高温度；

       3）载气流量偏低；

       4）进样量大，减少进样量货增大分流比；

       5）进样器或气化室被高沸点杂质或残留污染等。

4

出现鬼峰

       1）色谱柱有残留，未完全老化；

       2）气化室、注射针等被污染或载气纯度不够；

       3）气化温度过高使样品某些组分分解；

       4）样品中有空气或TCD、ECD等密封性差（有漏气）等。

5

操作条件不变，原来可以分离的峰不见了？

       1）色谱柱被污染或者失效；

       2）载气系统被污染（载气纯度低或过滤器失效）；

       3）注射垫或注射针漏气等。

6

进样后不出峰或者峰很小？

      1）检查检测器的信号值，信号值正常时，优先考虑进样口问题；

      2）进样针漏气或者堵塞；

      3）进样温度太低导致样品不能气化或柱温太低，导致样品在柱中冷凝；

      4）如果是FID，需要检查FID火焰是否点燃等。

7

连续进样时，重复性差

       1）进样技术差；

       2）载气泄露或者流速不稳定；

       3）检测器、色谱柱或衬管等被污染；

       4）注射针有泄漏等。

8

基线向上漂移

       1）检测器温度达到设定温度并稳定2h以上，基线不稳定，检测器受污染，需要进行清洗；

       2）色谱柱未完全老化，有残留；

       3）载气流速下降，重新调整载气压力；

       4）色谱柱固定相可能被破坏等。

9

基线向下漂移

       1）进样口隔垫漏气；

       2）气路系统漏气或载气流量波动；

       3）色谱柱未老化完全等。

10

样品分离度下降

       1）色谱柱被样品或其他杂质污染；

       2）色谱柱固定相流失严重导致无法达到所需要的柱效或分离度等。

您是否困惑过，证书上的有效期如何看？

买的标准物质一个是盐的形式，一个是非盐的形式，该如何使用？

买的标准物质是A溶剂，上样确是B溶剂，该如何进行转换？

别急，接下来小编带您一一简析！

一、标准物质的有效期有哪些标识方法？

证书上标识的有效期是指在证书上的存储条件以及产品未开封的情况下的有效期，反映的是标准物质的保存期限，市面上常见的标准物质的有效期有如下的标识方法：

1

在证书上标识Expiration 或者 Expiry Date 后面的时间即该产品的有效期，如下图证书有效期为2022年5月31日。

2

 在证书上标识Retest Date后面的时间作为该产品的有效期，如下图证书有效期到2021年6月10日。

（注：Retest Date是重检日期，是指生产厂家在这个时间之前会对产品进行重检，重检之后，特性量值未发生变化，会对该产品进行有效期的延长，但客户实际一般参考Retest Date作为该产品的有效期）

3

在证书上标识Expiration Date后面，如下图显示该产品在未开封的情况下，长期有效。

（注：该类产品是脂肪酸类，该类型产品对空气敏感，生产厂家对包装进行惰性化处理，瓶子内部充满氮气，所以该产品未开封，不和空气接触能保证产品长期有效）

4

下图证书表示的是该产品卖出去一年有效，卖出的时间点是以Sales Date后面的印章时间为准。

（注：如该证书上Sales Date后面没有关于时间的印章，向厂家投诉，更换正确的产品）

二、盐和非盐标准物质，在使用时的注意事项？

1

两者的差异往往体现在外观性状、溶解度、CAS号上；

例如：

2

对于色谱分析而言，一般情况下，成盐与非盐形式的有机物可以通用，但是注意溶解性能的差异；

3

在溶液配制过程中，称取同等质量的话，两者有摩尔质量差，定量分析要注意换算。

三、标准溶液如何进行溶剂转换？

1）溶剂的互溶性以及保证目标分析物充分溶解；

2）新的溶剂与目标化合物的稳定性；

3）溶剂效应，尽量使用流动相进行稀释上样，不能做到用流动相稀释上样的情况下，尽量降低进样量。

溶剂效应带来呕吐毒素出峰异常的案例分享

图1和图3非流动相稀释上样谱图，图1进样50uL，峰型异常，图3降低进样量，峰型正常。

图4和图5流动相稀释上样谱图，无论进样是10uL还是50uL，峰型都正常。

《干货丨样品称量准确度影响——温度篇》里针对电子天平准确度的影响，我们从环境因素分析温度对样品称量准确度的影响。这期我们将继续从环境因素分析静电作用对样品称量准确度的影响。

静电现象在我们的日常生产、生活中无处不在。若称量容器上带有静电，会导致电子天平的显示值长时间波动，无法稳定显示准确的称量结果，影响样品称量准确度。在称量过程中，经过摩擦的称量样品、称量容器及实验人员的衣物上等都可能带有静电。而且，样品的带电量也会随着实验人员的具体操作以及实验人员与电子天平之间距离的远近而变化。如：对没有静电屏蔽功能的电子天平加载、卸载称量样品的操作和与秤盘或桌面的接触，样品的带电量都会实时发生变化，看似完全相同的操作，却毫无规律可言；实验人员身上所带的静电，随着实验人员身体距离天平的远近变化，也会造成数值的变化，使得样品称量准确度受到影响。

如何避免静电对称量准确度的影响？

1 控制称量环境湿度在40% - 70%之间

在这个湿度范围内，物体表面会形成一层极微薄的导电水层，使其电阻率大大降低，电荷快速转移，静电作用减弱；

2 称量容器尽量选用金属或玻璃材质

避免使用塑料材质的称量容器。塑料常规情况都是绝缘体，电荷集聚在其表面无法流动就变成了静电聚集体，使得静电作用增强；

3 电子天平安装专门的消除静电装置

安装专门的消除静电装置并将秤盘接地，可以有效降低静电作用；

4 zui好穿着棉质实验服或防静电面料的衣物

操作人员在做称量的过程中，zui好穿着棉质实验服或防静电面料的衣物，必要时操作人员同时带防静电手环，避免因为人员移动而产生静电。

实验室样品称量操作中影响准确度的因素有很多，其中静电是不容小觑的一个因素。针对上述分析静电产生的原因及应对措施，可以有效减少静电作用对称量操作的影响，提高称量准确度。

络合滴定

络合滴定是以络合反应为基础的滴定分析方法，又称为配位滴定。络合反应亦是路易斯酸和路易斯碱结合生成简单络合物或螯合物的反应（金属离子作为路易斯酸提供空轨道，接受路易斯碱所提供的未成键电子对形成化学键）。

简单络合物由ZX离子和单齿配体组成，如同多元弱酸一般，常形成逐级络合物，存在逐级解离平衡关系，限制了其在滴定分析中的应用，一般常用作掩蔽剂、显色剂和指示剂。

螯合物由同一金属离子与两个或多个配位体形成螯合环的环状结构配合物。螯合物也存在逐级络合现象，但可以通过控制适当的反应条件，得到实验所需的络合物，常被用做滴定剂和掩蔽剂。例如乙二胺四乙酸（EDTA）是含有羧基和氨基的螯合剂，能与多种硬酸、软酸型阳离子结合形成具有多个五原子环的稳定螯合物。其结构式如图1所示，由于其良好的稳定性及成本低廉等原因成为分析化学中应用最广泛的螯合剂。

EDTA结构式

在络合滴定中，通常利用一种能与金属离子生成有色络合物的显色剂来判断滴定反应是否达到反应终点，这种显色剂称为金属离子指示剂。下表为络合滴定中常用金属指示剂。

在络合滴定中，根据金属离子络合物稳定常数、络合速率、指示剂封闭效应、溶液酸碱度等要求，我们可以采用不同的滴定方法来满足实验需求并将其运用到实际生产中去。